Lipoxigenasas de macrófagos humanos y síntesis de mediadores lipídicos inflamatorios

Abstract

La inflamación es una respuesta fisiopatológica universal que tiene el objetivo de mantener la homeostasis. Su relevancia biomédica se evidencia en el creciente número de condiciones patológicas asociadas a inflamación crónica. Los macrófagos, presentes en todos los tejidos del organismo, desempeñan funciones clave en la homeostasis y exhiben una notable plasticidad fenotípica, lo que los posiciona como actores centrales en la transición de la fase inicial hacia la resolución del proceso inflamatorio. Este proceso es dirigido por una diversidad de mediadores inflamatorios, dentro de los cuales destacan las oxilipinas, lípidos bioactivos derivados de la oxigenación de ácidos grasos poliinsaturados liberados de las membranas celulares. Las lipoxigenasas (LOX), ciclooxigenasas (COX) y citocromos P450 (CYP), junto con sus proteínas activadoras y enzimas asociadas, generan más de 150 moléculas con efectos biológicos potentes y diversos, de manera temporal y espacialmente coordinada. Estudios previos sugieren que los fenotipos de macrófagos inducidos durante la inflamación expresan y distribuyen diferencialmente las isoformas LOX, pero la literatura muestra discrepancias en este aspecto. En este trabajo se estudió la expresión, localización subcelular y síntesis de oxilipinas de macrófagos humanos polarizados. Para ello, se realizó la puesta a punto del cultivo de macrófagos primarios derivados de monocitos de sangre, modelo de referencia para el estudio de la biología de macrófagos humanos. Los macrófagos fueron polarizados a los fenotipos MLPS y MIL-4, que fueron caracterizados por su morfología, expresión de marcadores de superficie mediante citometría de flujo y producción de citoquinas por ELISA. La expresión de todas las isoformas LOX de leucocitos humanos fue determinada por Western Blot, con un patrón diferencial entre fenotipos. Mientras que 5-LOX se expresó de manera similar en ambos fenotipos, su proteína activadora (FLAP) se observó predominantemente en los MLPS. Las isoformas 12-LOX, 15-LOX1 y 15-LOX2 se encontraron mayormente o exclusivamente en MIL-4. La compartimentación de las 5-LOX y 15-LOX1 fue explorada por inmunofluorescencia detectando para ambas isoformas una tinción predominantemente nuclear, sin cambios significativos por el estímulo con zymosan y de forma similar entre los fenotipos. El perfil de oxilipinas fue analizado por un método de lipidómica basado en HPLC-MS/MS, previamente desarrollado en el laboratorio, que permitió identificar y cuantificar eicosanoides, octadecanoides y docosanoides derivados de los ácidos araquidónico, eicosapentaenoico, linoleico y docosahexaenoico (AA, EPA, LA, DHA respectivamente). En macrófagos polarizados suplementados con PUFAs y estimulados con zymosan, se observó una mayor cantidad de PGE2 y TxB2 en el fenotipo MLPS, sin diferencias en los derivados monohidroxilados de los PUFAs. Se detectaron marcadores de las vías de síntesis de Maresinas (14-HDHA), RvD (17-HDHA) y RvE (18-HEPE). Si bien se logró detectar LXA4, los mediadores lipídicos prorresolutivos especializados (SPMs) del DHA y EPA, no fueron detectados en ninguna condición. Esto concuerda con observaciones de otros grupos de investigación que cuestionan tanto la posibilidad de detectar SPMs en muestras biológicas como la relevancia fisiológica de estas oxilipinas. Además, se evaluaron líneas celulares para el estudio de las oxilipinas producidas por las LOX de macrófagos. Los macrófagos derivados de la línea de monocitos THP-1, polarizados a MLPS y MIL-4, presentaron una expresión de la maquinaria biosintética y un perfil de oxilipinas muy similar al de los macrófagos derivados de monocitos sanguíneos. Por tanto, se postulan como una herramienta valiosa para el estudio de las LOX de macrófagos y la resolución de la inflamación a nivel celular.

Inflammation is a universal pathophysiological response aimed at maintaining homeostasis. Its biomedical relevance is evidenced by the increasing number of pathological conditions associated with chronic inflammation. Macrophages, present in all body tissues, play key roles in homeostasis and exhibit remarkable phenotypic plasticity, positioning them as central actors in the transition from the initial phase to the resolution of the inflammatory process. This process is directed by a diversity of inflammatory mediators, among which oxylipins, bioactive lipids derived from the oxygenation of polyunsaturated fatty acids released from cell membranes, stand out. Lipoxygenases (LOX), cyclooxygenases (COX), and cytochromes P450 (CYP), along with their activating proteins and associated enzymes, generate more than 150 molecules with potent and diverse biological effects, in a temporally and spatially coordinated manner. Previous studies suggest that macrophage phenotypes induced during inflammation differentially express and distribute LOX isoforms, but the literature shows discrepancies in this regard. In this work, we studied the expression, subcellular localization, and synthesis of oxylipins in polarized human macrophages. For this purpose, we optimized the culture of primary macrophages derived from blood monocytes, a reference model for studying the biology of human macrophages. The macrophages were polarized to the MLPS and MIL-4 phenotypes and were characterized by their morphology, surface marker expression by flow cytometry, and cytokine production by ELISA. The expression of all LOX isoforms in human leukocytes was determined by Western Blot, showing a differential pattern between phenotypes. While 5-LOX was similarly expressed in both phenotypes, its activating protein (FLAP) was predominantly observed in MLPS. The 12-LOX, 15-LOX1, and 15-LOX2 isoforms were mostly or exclusively found in MIL-4. The compartmentalization of 5-LOX and 15-LOX1 was explored by immunofluorescence, detecting both isoforms predominantly in the nucleus, with no changes due to zymosan stimulation and similarly between phenotypes. The oxylipin profile was analyzed by a lipidomics method based on HPLC-MS/MS previously developed in the laboratory, which allowed the identification and quantification of eicosanoids, octadecanoids, and docosanoids derived from arachidonic, eicosapentaenoic, linoleic, and docosahexaenoic acids (AA, EPA, LA and DHA respectively). In polarized macrophages supplemented with PUFAs and stimulated with zymosan, higher amounts of PGE2 and TxB2 were observed in the MLPS phenotype, with no differences in the monohydroxylated derivatives of PUFAs. Markers of the maresin (14-HDHA), RvD (17-HDHA), and RvE (18-HEPE) synthesis pathways were detected. While LXA4 was detected, DHA and EPA SPMs were not detected under any condition, in line with observations from other research groups questioning the feasibility of detecting SPMs in biological samples and their physiological relevance. Additionally, cell lines were evaluated for the study of oxylipins produced by macrophage LOX. Macrophages derived from the THP-1 monocyte line, polarized to MLPS and MIL-4, presented biosynthetic machinery expression and oxylipin profiles very similar to those of macrophages derived from blood monocytes, proposing them as a valuable tool for the study of macrophage LOX and the resolution of inflammation at the cellular level.