Caracterización bioquímica y funcional de dos sustratos de la Ser/Thr quinasa PknG de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, el agente causante de la tuberculosis, representa un grave problema de salud pública, constituyendo la primera causa de muerte por un agente infeccioso a nivel mundial. Se estima que alrededor de un tercio de la población es portador sano de la enfermedad. En nuestro país la incidencia de la enfermedad ha aumentado durante los últimos años. El genoma de M. tuberculosis codifica 11 Ser/Thr quinasas de tipo eucariota denominadas Pkns. Una de ellas, PknG, cumple un rol tanto en el metabolismo de la bacteria como en la patogénesis, y ha cobrado gran relevancia como una de las moléculas centrales para la sobrevida de la bacteria dentro del ambiente hostil del hospedero. Con el fin de descubrir nuevas rutas de señalización reguladas por PknG, nuestro grupo de trabajo desarrolló una estrategia basada en cromatografía de afinidad acoplada a espectrometría de masa que nos permitió identificar interactores y sustratos in vitro de esta quinasa. Entre las proteínas identificadas, se encuentran los sujetos de estudio del presente trabajo, GlnA1 y FhaA. En este trabajo, nos propusimos profundizar en el rol biológico de ambas proteínas. La primera de ellas GlnA1, es una enzima muy estudiada, que posee un rol central en la asimilación de nitrógeno. Mediante ensayos de fosforilación in vitro determinamos que GlnA1 es fosforilada por PknG en la Serina 57 y que este residuo es importante para el desarrollo de la actividad enzimática. También revisamos el estado de fosforilación endógena de GlnA1 en extractos totales, así como en proteína recombinante purificada a partir de bacterias crecidas en condiciones de distinta biodisponibilidad de nitrógeno. FhaA, por otra parte, es una proteína poco estudiada, para la cual se ha propuesto un rol en la síntesis de peptidoglicano. Mediante análisis proteómicos logramos conocer el entorno molecular en el cual se encuentra enmarcada esta proteína. Utilizando distintas técnicas de microscopía confocal, microscopía electrónica y análisis de imágenes, logramos demostrar que FhaA cumple un papel central en la correcta localización de la maquinaria responsable de la elongación celular, así como en el crecimiento asimétrico desde los polos y por tanto en la diversificación poblacional, procesos de gran relevancia biológica pero muy poco caracterizados al día de hoy. A partir de esta tesis surge la posible regulación de GlnA1 por fosforilación, un aspecto que hasta el momento había pasado inadvertido. Por otra parte, nuestros resultados nos permiten postular a FhaA como un integrante del elongasoma, con un rol central en el crecimiento polar asimétrico.