Reducción y oligomerización de peroxirredoxinas humanas su rol en la señalización por H2O2

Abstract

La paradoja de la vida en aerobiosis es que el mismo O2 que respiramos puede resultar tóxico y terminar generándonos daño. Hoy sabemos que la acción de oxidantes en los organismos aerobios no es exclusivamente dañina, de hecho, necesitamos un flujo bajo y constante para funcionar fisiológicamente. Dentro de estos oxidantes, el peróxido de hidrógeno (H2O2) se destaca como molécula señalizadora por su estabilidad, capacidad de difundir por membranas biológicas y ser disparador de distintos procesos fisiológicos. Por lo tanto, en el metabolismo del H2O2 tiene que haber mecanismos para disminuir todo aumento que represente un peligro y al mismo tiempo permitir niveles necesarios para inducir eventos de señalización. Si bien varios componentes del sistema antioxidante son capaces de reducir el H2O2, las peroxirredoxinas (Prx) se destacan por su especificidad, reactividad y abundancia. Las Prx son enzimas ubicuas que catalizan la reducción de una variedad de peróxidos mediante la excepcional reactividad de su cisteína “peroxidática” (CP). Dentro de esta familia, las AhpC/Prx1, tienen una cisteína de sitio activo adicional, llamada “resolutiva” (CR), que reacciona con la forma oxidada de CP para generar un disulfuro intermolecular, que es reducido por el sistema tiorredoxina (Trx) a expensas de NADPH. Además, tienen una estructura cuaternaria que consiste en un arreglo de homodímeros que forman un decámero (o dodecámero), cuya estabilidad depende del estado de oxidación de sus cisteínas de sitio activo. El hecho de ser ubicuas y de participar en procesos fisiológicos relacionados con el H2O2, colocaron a estas Prx en el foco de las investigaciones en señalización redox. En este contexto, se las destaca por su capacidad de transferir la oxidación desde el H2O2 a cisteínas en proteínas blanco de señalización, regulando su función. La idea principal de este trabajo fue caracterizar ciertos aspectos del ciclo catalítico y dinámica estructural de AhpC/Prx1, para entender las bases bioquímicas de su función en la señalización por H2O2. Trabajamos con dos Prx humanas citosólicas (HsPrx1 y HsPrx2) y evaluamos la reducción de su forma disulfuro con distintas Trx y reductores de bajo peso molecular, para lo cual se desarrolló una metodología específica. Estudiamos la dinámica de oligomerización en distintas condiciones mediante la implementación del análisis de tiempos de vida de emisión de fluorescencia por fasores, e investigamos el efecto de alterar el equilibrio decámero-dímero sobre la cinética de oxidación. Además, comenzamos a caracterizar la reacción e interacción de estas Prx con las proteínas blanco de señalización anexina A2 (ANXA2) y cistationina-β-sintasa (CBS). Dentro de los resultados más destacados, caracterizamos las interacciones en el complejo Prx-Trx, donde observamos que los aminoácidos más conservados son los más importantes para su formación. Además, notamos que la reactividad de la cisteína nucleofílica de Trx (CN) se vio aumentada en el complejo ya que su tiolato queda menos expuesto al solvente y que el residuo de triptófano (W31) conservado en Trx tiene un rol estérico en la catálisis. En cuanto a la oligomerización, vimos que HsPrx2 forma decámeros más estables que HsPrx1 y que la fuerza iónica y agentes desnaturalizantes, influyen en la distribución de especies en el equilibrio. La cinética de la formación del disulfuro aumentó hasta 10 veces cuando se desestabilizó al decámero y disminuyó significativamente al estabilizarlo. Teniendo en cuenta el estudio con blancos de señalización, observamos que ANXA2 interacciona y reacciona con HsPrx2 formando disulfuros mixtos. Por último, el estudio de la influencia de HsPrx1 y HsPrx2 sobre la oxidación de CBS por H2O2 sugiere que, si bien ambas Prx participan del proceso, HsPrx2 es la que más contribuye. En conclusión, las AhpC/Prx1 reúnen características claves para ser reguladores maestros del metabolismo del H2O2. Su excepcional reactividad y su capacidad de transferir la oxidación a proteínas específicas, permite integrar la información de los niveles de H2O2 a otros procesos celulares. Además, su plasticidad estructural puede llevar a cambios en la reactividad que permitan ajustar la respuesta al H2O2 en distintas regiones subcelulares ante determinados estímulos.