Estudio del metabolismo de D-xilosa y su regulación en Herbaspirillum seropedicae Z69

Abstract

La D-xilosa es el segundo carbohidrato más abundante en la naturaleza. Se encuentra en alta proporción en la biomasa lignocelulósica, el subproducto renovable más abundante en el planeta. La biomasa es usualmente quemada para la generación de energía. Sin embargo, la misma contiene compuestos que constituyen una excelente oportunidad para producir biocombustibles de segunda generación y bio-productos con valor agregado, en el contexto de las biorrefinerías. Se han estudiado pocos microorganismos capaces de metabolizar la D-xilosa eficientemente. La búsqueda de nuevos microorganismos o de rutas catabólicas novedosas capaces de metabolizar esta pentosa forma parte de un área de investigación importante para la biotecnología acoplada a las cadenas agroindustriales. Herbaspirillum seropedicae es una β-proteobacteria capaz de crecer en presencia de D-xilosa y acumular más del 50% de su peso seco como poli-3-hidroxibutirato (PHB), biopolímero termoplástico y biodegradable. Para la degradación de D-xilosa emplea rutas no fosforilativas, cuyo primer paso está catalizado por la enzima D-xilosa deshidrogenasa dependiente de NAD+ (G5B88 22805, xylB). El mutante Z69△xylB es capaz de crecer en D-xilosa, aunque con menor velocidad de crecimiento. En esta tesis de doctorado, se identificaron las rutas metabólicas implicadas en el catabolismo de D-xilosa en H. seropedicae Z69 y Z69△xylB mediante RNA-seq, y el subsecuente análisis del fenotipo de varios mutantes apolares dirigidos en los genes identificados. De acuerdo a los resultados, H. seropedicae emplea rutas no fosforilativas para el catabolismo de D-xilosa. La porción inferior de este metabolismo involucra la co-expresión de dos rutas: la ruta de Weimberg que produce α-cetoglutarato y una ruta nueva recientemente descrita que sintetiza glicolato y piruvato. Esta nueva ruta parece ser muy importante para el catabolismo de D-xilosa, ya que el mutante en el último paso, Z69△mhpD, fue capaz de crecer en esta pentosa luego de una extensa fase lag (40-50 horas). Por otro lado se identific´o que el crecimiento en D-xilosa del mutante Z69△xylB es debido a la expresión de la L-arabinosa deshidrogenasa codificada por el gen araB (G5B88 05250) que puede utilizar D-xilosa como sustrato. Además, se estudiaron los mecanismos regulatorios implicados en el metabolismo de D-xilosa en H. seropedicae Z69. Se construyó el mutante apolar dirigido en el gen regulador xylR, Z69△xylR, el cual presentó crecimiento reducido (50%) en D-xilosa. Por otro lado, se identificó que, los genes xylFGH, que codifican para un transportador de D-xilosa del tipo ABC, y los genes xylBD y xylC, que codifican para las enzimas de la ruta no fosforilativa superior, se encuentran formando unidades transcripcionales (operones) diferentes. Luego, se observó que xylR estaría regulando positivamente la expresión de los genes xylFGH, xylBD, xylC y xylR, en presencia de D-xilosa o D-glucosa. Mientras que los genes xylA y mhpD (rutas no fosforilativas inferiores) y araB no estarían regulados por xylR. Finalmente, mediante ensayo de retardo en gel, del inglés Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), se observó que rXylR se une a las regiones promotoras de los genes xylFGH y/o xylR y a la región promotora de los genes xylBD y que esta unión es fomentada por la presencia de D-xilosa.