Nanobodies inhibidores de la vía PD-1/PD-L1con potencial aplicación en inmunoterapia contra el cáncer

Abstract

El sistema inmune es capaz de identificar y eliminar de forma específica a las células tumorales. La mayoría de los tumores presentan infiltrados de linfocitos (TILs), siendo los linfocitos T citotóxicos CD8+ una pieza clave en la actividad antitumoral del sistema inmune. Sin embargo, en el microambiente tumoral se desarrolla un ambiente inmunosupresor que puede disminuir la actividad de los TILs, y por lo tanto afectar su habilidad para eliminar a las células tumorales. De hecho, muchos tipos tumorales son capaces de sobre-expresar ligandos de receptores co-inhibidores de células T (por ejemplo: PD-L1, ligando de PD-1), por lo que el bloqueo de estas señales de inhibición es una estrategia interesante para la revigorización de la respuesta inmune antitumoral. En los últimos años la industria farmacéutica se ha volcado hacia el desarrollo de anticuerpos monoclonales bloqueantes de vías de co-inhibición de células T (en particular CTLA-4 y PD-1/PD-L1), con los cuales se ha obtenido un éxito sin precedentes en varios tipos tumorales. Algunos anticuerpos ya se encuentran aprobados por distintas agencias reguladoras de medicamentos para su uso en pacientes con melanoma y cáncer de pulmón, entre otros. Sin embargo, estos tratamientos presentan desventajas que limitan su aplicación. En primer lugar, su muy elevado costo y la falta de biomarcadores que sean buenos indicadores pronóstico de la respuesta de los pacientes a estas terapias. Por otro lado, los efectos adversos de carácter autoinmune relacionados con estas terapias en ocasiones son graves y requieren de la discontinuación del tratamiento. Los nanobodies son anticuerpos monodominio recombinantes derivados del dominio de unión al antígeno de los anticuerpos de cadena pesada presentes en camélidos y algunos peces cartilaginosos. Representan uno de los fragmentos de reconocimiento específico más pequeño conocido (con un peso aproximado de 15 kDa), y poseen propiedades únicas que les otorgan numerosas ventajas para su utilización en diversas aplicaciones biotecnológicas. Las principales ventajas que presentan son su elevada estabilidad fisicoquímica, solubilidad y especificidad, así como la facilidad en su manipulación genética debido a su naturaleza monodominio, y su correcta expresión a partir de distintos sistemas, tanto procariotas como eucariotas. Estas características los convierten en candidatos prometedores para su expresión a partir de las células del propio individuo mediante terapia génica. El trabajo de esta tesis se focalizó en la selección de nanobodies específicos para PD-1 y PD-L1 (tanto las variantes humanas como las murinas), con potencial aplicación en el área de la inmunoterapia contra el cáncer. Para evaluar la actividad antitumoral de estos nanobodies, se utilizaron vectores de terapia génica derivados del virus adeno-asociado (AAV). Una de las ventajas de utilizar vectores de terapia génica es la posibilidad de promover la expresión localizada de la proteína terapéutica en el sitio tumoral, disminuyendo los efectos adversos derivados de la administración sistémica, como ocurre en el caso de los anticuerpos monoclonales en la clínica. En una primera etapa de esta tesis, se seleccionaron nanobodies específicos para PD-1 y PD-L1 mediante la técnica de phage display, utilizando bibliotecas en fagos filamentosos generadas a partir de llamas (Lama glama) inmunizadas con los antígenos correspondientes. Esta etapa fue realizada en la Cátedra de Inmunología de Facultad de Química (Universidad de la República, Uruguay), mientras que el resto de los experimentos fueron llevados a cabo en el Centro de Investigación Médica Aplicada de la Universidad de Navarra (España). Posteriormente, los nanobodies seleccionados fueron evaluados en ensayos in vitro para determinar su capacidad de inhibición de la unión PD-1/PD-L1. Tras haber identificado dos nanobodies capaces de inhibir la unión PD-1/PD-L1 in vitro, se subclonaron en vectores de AAV y se verificó la correcta expresión de los mismos a partir de estas construcciones en células eucariotas mediante transfecciones. En la última etapa de la tesis, se seleccionó uno de los nanobodies inhibidores de la unión PD-1/PD-L1 para su evaluación in vivo. Para ello, se generaron las partículas virales recombinantes de AAV8 conteniendo en su genoma recombinante el cassette de expresión para el nanobody. En primer lugar, las partículas virales recombinantes fueron inoculadas por vía sistémica en ratones C57BL/6 para evaluar la expresión del nanobody a largo plazo. Luego se evaluó la actividad antitumoral del nanobody expresado a partir de estos vectores virales en un modelo de tumor subcutáneo derivado de la línea celular de adenocarcinoma colorrectal MC38. La propuesta y los resultados presentados en esta tesis son novedosos en el área de la inmunoterapia contra el cáncer, puesto que el desarrollo de nanobodies inhibidores de la vía PD-1/PD-L1 es un campo de investigación que está comenzando a ser explorado, con muy pocos trabajos publicados y que además no están enfocados en el área de la inmunoterapia. Además, el uso de vectores de terapia génica para nanobodies es un área con muy pocos antecedentes, no existiendo reportes de expresión de nanobodies a partir de vectores de AAV como terapia contra el cáncer.