Posible rol secretor del proceso apical de las células que contactan el líquido cefalorraquídeo en la médula espinal de ratones

Abstract

Las cerebrospinal fluid-contacting neurons son neuronas GABAérgicas de la médula espinal, cuyos somas se localizan en la zona subependimaria, y poseen un proceso apical que contacta el líquido cefalorraquídeo. Las propiedades funcionales de estas células son objeto de debate en la actualidad. Si bien algunos autores postulan un rol sensorial químico y mecánico del proceso apical en ratones, basados en evidencias ultraestructurales preliminares de nuestro laboratorio (i.e. presencia de elementos túbulo-vesiculares en el proceso apical), decidimos explorar la hipótesis de la secreción vesicular de GABA en dicho compartimento. Para poner a prueba esta hipótesis, implementamos múltiples enfoques experimentales utilizando como modelo de estudio ratones transgénicos GATA3, los cuales expresan la proteína fluorescente verde en las células de interés. Para resolver la ultraestructura de los procesos apicales obtuvimos imágenes mediante microscopía electrónica de transmisión. La presencia de un intrincado sistema de túbulos y vesículas de apariencia aplanada en el proceso apical fue compatible con la presencia de un aparato secretor. También buscamos evidencias moleculares de secreción vesicular mediante técnicas inmunohistoquímicas. Si bien evidenciamos la presencia del transportador vesicular de GABA en los procesos apicales, no hallamos indicios de otras proteínas presinápticas como la synaptotagmina 1 y 2, o la syntaxina 4. Por otra parte, pusimos en evidencia la presencia de receptores funcionales GABAA en el proceso apical mediante el desenjaulado de GABA en dicho compartimento. De producirse secreción de GABA desde el proceso apical, este resultado permitiría especular respecto de un posible mecanismo de comunicación autócrina o parácrina. Para obtener evidencias electrofisiológicas de la secreción de GABA desde el proceso apical, decidimos utilizar la técnica de "sniffers de GABA" que consiste en obtener registros electrofisiológicos a partir de células que expresen receptores GABA-A, capaces de detectar la presencia de GABA cerca del sitio de liberación durante la estimulación eléctrica de la célula secretora. Con esta finalidad cultivamos células HEK-293 modificadas genéticamente para expresar dicho receptor (células HEK-GABA). Mediante este abordaje, y contrariamente a lo esperado, no obtuvimos corrientes GABAérgicas en las células HEK-GABA como consecuencia de la estimulación eléctrica de las cerebrospinal fluid-contacting neurons. Por lo tanto, contemplamos la posibilidad de secreción de un contenido vesicular diferente de GABA. Para explorar esta alternativa realizamos mediciones de capacitancia de membrana en los procesos apicales. En las cerebrospinal fluid-contacting neurons la despolarización y posterior reclutamiento de conductancias activas de calcio, no provocó cambios en la capacitancia de membrana en el proceso apical. Sin embargo, si bien las cerebrospinal fluid-contacting neurons presentan conductancias activas de calcio, resulta oportuno señalar que no contamos aún con evidencias de la presencia de estas conductancias en el proceso apical. Además, la secreción vesicular dependiente de calcio podría ser mediada por otros sustratos moleculares permeables a dicho ion, como PKD2L1. Puesto que estos canales no son sensibles a voltaje, una posibilidad que contemplamos es que la aplicación de pulsos despolarizantes no sea eficaz para mediar un incremento de la concentración de calcio en el proceso apical. Si bien aquí no hemos obtenido evidencias funcionales de la secreción de GABA desde el proceso apical, consideramos necesario explorar nuevas avenidas experimentales para descartar esta hipótesis por completo.