Abordaje multidimensional de la infección por el virus de la hepatitis E (HEV): ecología viral, caracterización, análisis de la respuesta celular in vitro y estudio de resistencia a la ribavirina

Abstract

La infección con el virus de la hepatitis E (HEV) es una de las principales causas de hepatitis aguda a nivel mundial. La presentación clínica de hepatitis E se manifiesta principalmente como una enfermedad aguda y autolimitada, aunque se han reportado frecuentemente casos crónicos con manifestaciones extrahepáticas en pacientes trasplantados e individuos inmunocomprometidos, en los cuales el tratamiento con ribavirina (RBV) es la única terapia disponible. HEV pertenece a la familia Hepeviridae, dentro de la cual encontramos la especie Paslahepevirus balayani que se divide en 8 genotipos (HEV1-HEV8) y en subtipos, y la especie Paslahepevirus alci que consiste en cepas de HEV provenientes principalmente de alces de Suecia (Alces alces), denominadas HEV-moose. HEV presenta un genoma ARN simple hebra de polaridad positiva de aproximadamente 7,2 Kb conteniendo tres marcos abiertos de lectura (ORF1-3) parcialmente solapados. HEV3 se transmite mayoritariamente por vía zoonótica en países industrializados a través del contacto directo con animales infectados o por el consumo de carne contaminada, particularmente por sus principales reservorios, el cerdo doméstico y el jabalí, aunque presenta un rango de hospedero en constante expansión, dónde se incluyen ciervos, ratas y conejos, entre otros. En 2011 se reportaron en Uruguay los primeros casos de infección aguda por HEV3 en humanos y los estudios de caracterización genética mostraron que no era posible asignarlos a ningún subtipo conocido. Además, recientemente por medio de un estudio serológico en donantes de sangre, se detectó una tasa de seroprevalencia de HEV de un 10% (10 veces mayor que el último análisis hace 20 años) y se reportó el primer caso de infección crónica, siendo uno de los pocos países de la región, permitiendo, por lo tanto, avanzar en el estudio de su epidemiología molecular y específicamente en la caracterización y clasificación de las cepas de HEV3, para lo cual se requiere obtener genomas completos. Por otro lado, se identificó también la presencia de anticuerpos anti-HEV en jabalíes, ARN de HEV3 en cerdos y se reportaron las primeras evidencias de que los pecaríes de cuello blanco (Pecari tajacu) son susceptibles a la infección por HEV3. En este contexto, se estima que HEV circula en Uruguay de forma principalmente asintomática y a través de mecanismos de transmisión no identificados, planteando la necesidad de estudiar más en profundidad este punto y llevando a plantearse qué otras especies animales podrían estar contribuyendo a la diseminación viral. A su vez, se desconocen los mecanismos moleculares y virológicos que llevan a la cronificación de hepatitis E, por lo que resulta importante avanzar en los estudios de su biología viral y resistencia antiviral mediante aproximaciones in vitro e in silico (ya que solamente hay estructuras cristalográficas disponibles para ORF2), especialmente para las variantes que circulan en Uruguay. Debido a los limitados conocimientos sobre la circulación de HEV en Uruguay y Sudamérica, en esta Tesis se llevó a cabo un amplio relevamiento serológico y molecular en distintas especies animales para comprender con un enfoque de Una Salud, la situación epidemiológica de HEV en el país. Los resultados obtenidos demuestran, por primera vez, la presencia de anticuerpos anti-HEV en ciervos Axis (Axis axis) silvestres con una tasa del 11,1% (6/54) y la co-circulación de cepas zoonóticas HEV3 y variantes moose HEV-like en esta especie. Asimismo, se detectaron anticuerpos anti-HEV en 10,5% (2/19) de venados, 20% (2/10) de pecaríes y 0,73% (1/137) de ovinos. Si bien más estudios son necesarios, estos resultados sugieren que esta especie de ciervos podría agregarse a lista de reservorios de HEV. A su vez, se obtuvieron los primeros genomas completos de HEV3 para el país y la región, correspondientes a un caso de infección crónica y a un suino (HEV_C1_Uy y HEV-8_uy), lo que permitió implementar estudios de clasificación más robustos. Los análisis filogenéticos y de p-distancia revelaron que todas las secuencias de HEV3 detectadas en el país en humanos, cerdos y ciervos Axis forman un cluster monofilético, con una importante divergencia con el resto de los subtipos de HEV3 conocidos. Por lo tanto, proponemos clasificar al cluster de secuencias identificadas en el país como subtipo 3o. Estos datos ponen de manifiesto la activa circulación de HEV entre animales silvestres y la población humana en Uruguay. Por otro lado, a partir de la cepa HEV_C1_Uy se generó un modelo in silico 3D de la proteína ARN polimerasa (RdRp) y se identificó el posible sitio de unión de RBV a esta proteína, brindando información sobre la interacción entre la RdRp de subtipo 3o y la droga. Además, fue posible aislar en células A549/D3 la cepa HEV_C1_Uy. Estudios in vitro realizados a partir de este aislamiento mostraron ausencia de resistencia a RBV (con un aumento en el valor de IC50) y una expresión diferencial de proteínas de apoptosis, citoquinas y de la vía NFκB, con respecto a una cepa europea del subtipo 3c de infección persistente (HEV_47832c) y a células sin infectar. En conclusión, esta Tesis contribuye a profundizar aspectos poco explorados de la epidemiología molecular en Uruguay, así como en la respuesta celular ante la infección por HEV, derivando en nuevas posibles líneas de investigación. Estos resultados podrían brindar herramientas para el diseño de potenciales políticas sanitarias para la prevención de la transmisión e infección por HEV.