Generación de herramientas para el estudio del ciclo celular en Toxoplasma gondii

Abstract

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que ha logrado en el curso de su evolución conquistar un gran rango de hospederos. Básicamente, infecta a cualquier animal endotermo lo cual le ha conferido una amplia distribución global. Se estima que la prevalencia de infecciones con T. gondii alcanzan a un tercio de la población mundial. Si bien estas infecciones en personas inmunocompetentes no representa una amenaza, en personas inmunocomprometidas pueden conducir al desarrollo de comorbilidades y mortalidad, así como alteraciones del desarrollo fetal en personas gestantes. Por otro lado, las infecciones por T. gondii constituye una de las principales causas de aborto en el ganado ovino, generando pérdidas millonarias en el sector. Aún resta mucho por explorar sobre la biología de este parásito. Sobre todo, en aspectos divergentes como lo es su particular división celular, ya que estos mecanismos constituyen excelentes blancos terapéuticos para el desarrollo de fármacos. La división celular y sus mecanismos de regulación se dan de forma muy particular en esta especie, la cual se encuentra dirigida por estructuras subcelulares físicas y coordinada por el centrosoma. El conocimiento de estos elementos reguladores y su dinámica durante la división celular, actualmente se encuentra obstaculizada debido a que la división celular transcurre en un período de tiempo muy breve. Esto impide que las fases del ciclo celular en el que transcurre la división, se encuentren representadas en una población asincrónica, dificultando de esta forma su estudio. Actualmente, los mecanismos de sincronización en el ciclo celular disponibles para T. gondii, son mecanismos farmacológicos que intervienen en la progresión de la replicación de ADN y en la división celular. Por consiguiente, es de relevancia el desarrollo de mecanismos no farmacológicos para la obtención de poblaciones sincronizadas que no afecten los diferentes mecanismos implicados durante la progresión del ciclo celular. En el presente trabajo, proponemos la generación de un sistema para la obtención de poblaciones enriquecidas en fases del ciclo celular específicas, a través del desarrollo de cepas indicadoras del ciclo celular. Mediante recombinación homóloga fue posible obtener una cepa que expresa una proteína de fusión formada por la ciclina Y y la proteína fluorescente tdTomato. Esta proteína de fusión constituye un reportero del ciclo celular ya que su expresión es dependiente del mismo, y como consecuencia su fluorescencia va a fluctuar en función de la fase. De esta forma es posible explotar esta fluorescencia fluctuante para seleccionar poblaciones por cell sorting, generando las poblaciones enriquecidas en fases específicas del ciclo celular. La evaluación de la cepa generada como reportera del ciclo celular y del sorting como herramienta de sincronización se llevó a cabo a través de microscopía y RT-qPCR. En los ensayos de microscopía se logró determinar: 1) que no se produce una afectación de la proliferación en el corto plazo provocada por el estrés del sorting, 2) que el alcance temporal de la sincronización es en el corto plazo, posiblemente durante el primer ciclo celular y 3) que la población sorteada con mayor expresión de la proteína de fusión se encuentra sincronizada parcialmente, posiblemente en G1 al momento que sale del sorting. Los resultados obtenidos arrojan la posibilidad de continuar con el desarrollo de esta herramienta como alternativa no farmacológica y menos invasiva con la fisiología del parásito frente a los actuales métodos de sincronización.