Rol de los conexones y los panexones de los pericitos hipocampales en el intercambio a través de la barrera hematoencefálica

Abstract

En el cerebro, los pericitos pericapilares actúan como iniciadores del acoplamiento neurovascular y reguladores del diámetro capilar en respuesta a la actividad neuronal. Acorde a estas funciones, los pericitos expresan proteínas contráctiles y responden a un gran número de moléculas vasoactivas y neuro-glio-transmisores. Los canales de membrana formados por conexinas (conexones) y panexinas (panexones) emergen como vías dinámicas para la interacción neuro-glio-vascular. Estos canales poseen un gran poro central que permite el ingreso de iones y trazadores, y la liberación de ATP. El mediador ATP regula el estado funcional de los pericitos mediante activación de receptores purinérgicos catiónicos P2X y/o metabotrópicos P2Y, generando aumento de calcio intrapericitario. En otros tipos celulares, los purino-receptores activan la apertura de los panexones. A la fecha no se ha reportado la existencia de canales de gran poro formados de conexinas y/o panexinas funcionales en los pericitos. Esta tesis propone que los pericitos expresan conexones y/o panexones funcionales quienes, al sensar cambios en las necesidades neuro-metabólicas responderían regulando su estado funcional. Esto resultaría en variaciones en la liberación de ATP al medio externo, en el nivel de calcio intrapericitario y del tono contráctil pericitario que desencadenarían ajustes del calibre capilar, del flujo sanguíneo y de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica a nivel de la microvasculatura. Los objetivos de esta tesis consistieron en: (1) desarrollar una metodología de identificación y caracterización de los pericitos en el árbol capilar del hipocampo del ratón, (2) determinar si los pericitos pericapilares expresan canales de gran poro funcionales y establecer su naturaleza molecular, (3) identificar los mediadores y las vías de regulación de estos canales en condiciones basales, (4) determinar si la funcionalidad de los canales de gran poro de los pericitos se modula por el neurotransmisor excitatorio glutamato y (5) por agentes vasodilatadores y constrictores, (6) establecer las implicancias de estos canales pericitarios sobre la regulación del calibre capilar y (7) sobre la performance cognitiva. Para responder estas interrogantes, se realizaron ensayos de captación de colorantes, aproximaciones farmacológicas, genéticas (mediante el empleo de ratones knock-out totales y condicionales para la Px1), funcionales, imagenológicas, detecciones inmunes y ensayos de reconocimiento de objetos novedosos. Inicialmente, demostramos que el fluoróforo TO-PRO-3 (642/661) actúa como un marcador específico de los pericitos del sistema nervioso cuando se aplicó en tejido vivo. La especificidad del TO-PRO-3 por los pericitos se confirmó frente a los marcadores clásicos de la membrana pericitaria NG2 y PDGFr, y la sonda NeuroTrace (500/525). El ingreso de TO-PRO-3 a los pericitos fue independiente de conexones y/o panexones, pero resultó altamente sensible a la temperatura sugiriendo que su incorporación podría estar mediada por transporte activo y mostró saturación. Además, un subgrupo de pericitos marcados con TO-PRO-3 expresó la proteína Alfa-SMA indicativo de su capacidad contráctil. Por otra parte, determinamos que los pericitos pericapilares del hipocampo de ratón expresaron canales de gran poro formados por Px1, denominados panexones. En situación basal, los panexones pericitarios se encontraron funcionales mediando una vía de intercambio entre los pericitos y el medio extracelular cerebral tanto en condiciones de vida libre (in vivo) como en las rodajas agudas de hipocampo (ex vivo). El mantenimiento del intercambio pericitario mediado por panexones, dependió del ATP extracelular y de la activación de los receptores pericitarios purinérgicos ionotrópico P2X7 y metabotrópico P2Y6. El neurotransmisor glutamato y el agente vasodilatador acetilcolina (ACh), disminuyeron el intercambio de los pericitos mediado por panexones efecto que se asoció con un aumento del calibre capilar (vaso-relajación). La disminución de la actividad de los panexones pericitarios en presencia de glutamato fue dependiente de la concentración y requirió de la activación de los receptores de tipo AMPA y NMDA y de un tipo celular diferente al pericito. Los agentes vasoconstrictores ATP y norepinefrina (NE), generaron un aumento del intercambio de los pericitos con el medio externo por activación de panexones que se acompañó de una disminución del calibre capilar (vaso-constricción). El incremento de la funcionalidad de los panexones pericitarios por el ATP fue concentración-dependiente presentando un máximo (0.1mM) para luego disminuir (≥ 0.15mM). El efecto de la NE también fue concentración-dependiente presentando saturación a concentraciones mayores a 0.015mM. La regulación del calibre capilar por el glutamato y de los agentes vasoactivos (ACh, NE y ATP) requirió de la expresión pericitaria de canales de panexina (Px1) funcionales. Finalmente, determinamos que los panexones pericitarios fueron fundamentales para el reconocimiento de objetos novedosos por el animal vivo. En conjunto, esta tesis presenta un mecanismo novedoso de señalización autócrina/parácrina donde los panexones funcionales y los receptores purinérgicos pericitarios son vías activas en condiciones basales. Los panexones pericitarios emergen como reguladores neuro-metabólicos para acoplar variaciones del diámetro capilar con la activación neuronal, en presencia de los agentes vasoactivos y durante la ejecución de procesos cognitivos. Futuros ensayos serán necesarios para elucidar las implicancias funcionales de los panexones pericitarios en el animal vivo en el control de la resistencia microvascular, el flujo sanguíneo capilar cerebral, y la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en condiciones fisiológicas y patológicas. En condiciones patológicas del sistema nervioso central, los panexones pericitarios pueden abrirse o cerrarse, promoviendo contracción/dilatación capilar; en la red capilar esto podría impactar en el intercambio a través de la barrera hematoencefálica y en la viabilidad del cerebro donde la Px1 pericitaria tendría tanto un rol deletéreo como neuro-protector.