Producción recombinante de la proteasa cisteínica proAntiacanthaina

Abstract

Las peptidasas catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos, participando en funciones esenciales en todos los organismos. Además, son utilizadas en distintos procesos biotecnológicos que requieren de grandes cantidades de estas enzimas y con diferentes grados de pureza, teniendo aplicaciones en la industria alimentaria, del cuero, detergentes y farmacéutica. La producción de proteínas recombinantes permite obtener una gran cantidad de proteína en períodos de tiempo relativamente cortos, en condiciones sencillas de cultivo, con un buen grado de pureza (si se utiliza un proceso cromatográfico) y a un bajo costo. Escherichia coli es uno de los organismos preferidos para la producción de proteínas recombinantes. Su uso como fábrica celular está bien establecido y se ha convertido en la plataforma de expresión más popular. Es usual que las proteínas recombinantes producidas en E. coli agreguen y formen cuerpos de inclusión. Es por ello, que se han estudiado varios métodos de solubilización y replegado de las mismas. Aún así, muchas proteínas sólo pueden replegarse bajo condiciones muy específicas, por lo que el desarrollo de métodos sistemáticos que puedan evaluar múltiples condiciones de replegado en paralelo es crucial. En este trabajo se logró producir de forma recombinante la proteína proAntiacanthaína, una proteasa cisteínica, de 39 KDa en su forma inactiva. La proenzima fué producida con éxito en E. coli BL21(DE3) y BL21(DE3)Arctic, utilizando tres vectores de expresión; dos de ellos, conteniendo las secuencias que codifican para las proteínas de fusión tiorredoxina y MBP, las cuales facilitan la obtención de la proteína de forma soluble. Puesto que en todos los casos la proteasa se produjo de forma insoluble en cuerpos de inclusión, fue necesario realizar una optimización del proceso de solubilización y replegado, con el fin de obtener una proteína recombinante funcional. Se decidió trabajar con la proteína recombinante obtenida con el vector pET-28a(+), que codifica para proAnt con fusión a etiqueta de polihistidina. Al ser la proteína de menor tamaño, el proceso de solubilización debería ser el más sencillo. Esta se solubilizó a partir de los cuerpos de inclusión en urea 6 M. Basándose en un kit comercial de replegado factorial fraccional, se realizaron los ensayos necesarios para obtener una mezcla de componentes óptima en el buffer de replegado del zimógeno recombinante. Una vez obtenido el zimógeno recombinante plegado correctamente, se ajustaron las condiciones para la activación y obtención de la peptidasa activa. Se ensayó la combinación de diferentes parámetros (pH, temperatura y tiempo) que permitieron el autoclivaje del fragmento pro de la antiacanthaína. El proceso de activación (incubación a 90 min, pH 4,2 y 55 °C), seguido por SDS-PAGE, produjo el clivaje del segmento pro, obteniéndose el tamaño correspondiente a la peptidasa activa.