Determinación de la localización del homólogo de la proteína centrosomal SAS4 en Toxoplasma gondii

Abstract

Toxoplasma gondii es un parásito protozoario, intracelular obligado, agente causal de la toxoplasmosis. Presenta un ciclo de vida complejo que incluye una fase asexual y una sexual. La fase sexual tiene lugar en felinos, su hospedero definitivo, donde el parásito se replica en el epitelio intestinal. En los hospederos intermediarios, tiene lugar la fase asexual, adonde el parásitos puede existir como taquizoito o bradizoito, el primero de replicación rápida con tropismo por el tejido neural y muscular, y el segundo de replicación lenta, el cual persiste por la vida del hospedero en sitios imunoprivilegiados. El taquizoíto es el estadío con el cual trabajamos, ya que es fácil de cultivar y propagar, y además es el estadío clínicamente más relevante ya que todas las manifestaciones clínicas asociadas a la toxoplasmosis se encuentran directamente relacionadas a su capacidad proliferativa. Al taquizoíto lo define su alta tasa de replicación, dándose esta en cualquier célula nucleada, dentro de la cual forma una vacuola parasitófora para protegerse de la inmunidad del hospedero. Los taquizoitos, presentan dos centros organizadores de microtúbulos (MTOC) diferentes, el centrosoma y el anillo polar apical (APR). El centrosoma nuclea los microtúbulos del huso mitótico, controlando el avance del ciclo celular, proceso fundamental para la patogenia. Mientras que el APR nuclea los microtúbulos corticales formando un corset, fundamental para la forma y resistencia mecánica de la célula. El centrosoma de T. gondii está formado por dos centriolos paralelos y pequeños, con microtúbulos simples (singletes) de simetría 9+1, una composición diferente a su contraparte en humanos, la cual está caracterizada por centriolos que en promedio son el triple de largos, y presentan microtúbulos en tripletes. Como se determina el largo de los microtúbulos en el centrosoma de T. gondii es desconocido. SAS-4 es una proteína que se conoce por formar complejos con tubulina, esenciales para la biogénesis del centrosoma, y que controla la elongación de los microtúbulos del centrosoma para determinar, en colaboración con otras proteínas, el largo del centriolo. Aquí nos proponemos investigar si el homólogo de SAS-4 en T. gondii tiene un rol similar, determinando su localización y aproximando su papel en la biogénesis del centrosoma y la elongación de microtúbulos del centriolo, estudiando su localización durante el ciclo celular. Para ello generamos una cepa transgénica de T. gondii mediante tecnología CRISPR/Cas9, en la que SAS-4 se encuentra fusionada a un epítope para el cual existen anticuerpos comerciales, lo cual nos permitió estudiar, mediante inmunofluorescencia indirecta, su localización durante el ciclo celular.