Aportes a la caracterización funcional de Higd1a mediante el análisis de mutantes de pérdida de función en el pez cebra

Abstract

El gen higd1a (hypoxia-induced gene domain protein-1a) fue descripto por su inducción en condiciones de hipoxia y baja concentración de glucosa. La proteína resultante se ubica en la membrana mitocondrial interna y se ha evidenciado que cumple roles fundamentales en la biogénesis de la cadena respiratoria y en el mantenimiento de la morfología mitocondrial. Higd1a se ha vinculado en numerosos trabajos con la supervivencia celular, promoviendo la proliferación y evitando la apoptosis en situaciones de hipoxia y estrés oxidativo. El gen descrito en numerosas especies, tiene una expresión modulada de forma compleja, siendo también blanco del factor HIF-1. En nuestro laboratorio se ha observado que su expresión cambia durante el desarrollo en rata, en particular durante la remodelación del sistema nervioso central. Por otra parte, embriones de pez cebra (Danio rerio) que carecen de la proteína Higd1a funcional mostraron varias alteraciones y una supervivencia aumentada en condiciones de hipoxia-anoxia. Recientemente, se ha reportado una proteína de la membrana mitocondrial interna con funciones similares y complementarias a las de Higd1a durante la biogénesis de la cadena respiratoria, la proteína Higd2a. Se postuló que la mayor supervivencia en los mutantes que carecen de Higd1a podría deberse a una compensación génica, que podría explicarse por un aumento en Higd2a. En este trabajo nos propusimos profundizar en la función de la proteína Higd1a y su participación en el desarrollo embrionario en pez cebra, utilizando mutantes knockout (KO) para higd1a. Se utilizaron dos líneas knockout para el gen higd1a, una contiene una mutación que cambia el marco de lectura (línea higd1a-KO Mut 1) y otra, de pérdida de sentido, introduce un codón de terminación prematuro (línea higd1a-KO Mut 2). Como parte de la caracterización funcional de higd1a, se realizó la observación de las estructuras cartilaginosas cefálicas en embriones salvajes y mutantes a los 5 dpf mediante tinción con Alcian Blue. Estos ensayos arrojaron la presencia de alteraciones fenotípicas en ambos mutantes siendo más pronunciadas en la línea higd1a-KO Mut 2 que Mut 1. Esto sugiere que el gen higd1a podría tener un rol en el desarrollo del tejido cartilaginoso. Se caracterizaron los niveles de expresión de los genes higd1a y higd2a mediante cuantificación de ADNc a las 24 hpf y 48 hpf utilizando qPCR. La expresión del gen higd1a disminuyó en la línea higd1a-KO Mut 2 a ambas edades mientras que en Mut 1, aunque presentaba una tendencia a la baja, no mostraba cambio significativo. La expresión del gen higd2a no varió significativamente en ningún mutante, por lo que no se pudo observar una compensación génica en los mutantes carentes de la proteína Higd1a funcional por parte de Higd2a. La disminución del ARNm de higd1a en la línea higd1a-KO Mut 2 podría ser explicada por el mecanismo de nonsense-mediated decay, proceso de vigilancia de ARNm donde aquellos que presentan un codón de terminación prematuro son detectados y degradados rápidamente. Con el fin de aproximarnos a un análisis proteómico comparativo que arroje luz sobre los mecanismos de compensación génica que puedan estar ocurriendo en los mutantes se puso a punto un protocolo de extracción de proteínas de embriones de pez cebra de 24 hpf. El mismo fue implementado en un ensayo exploratorio en condiciones de hipoxia, resultando muy satisfactorio.