Puesta en marcha de la técnica de CRISPR-dCas9i en microbacterias, focalizada en el gen de la fosfatasa de tirosina PtpA

Abstract

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente etiológico de la tuberculosis, enfermedad que causa en el mundo 1.3 millones de muertes por año. Aunque existe quimioterapia, esta enfermedad sigue siendo un problema debido a múltiples factores, el diagnóstico y tratamiento tardío o abandono de éste debido a su larga duración, la aparición de cepas multirresistentes, el deterioro de la salud general de la población y la falta de fondos suficientes a nivel mundial. Se estima que una de cada cuatro personas se infecta con Mtb y un 10% desarrolla la enfermedad. Dentro de las estrategias para evadir la respuesta inmune Mtb introduce en el citosol diversos factores de virulencia. Uno de ellos es la fosfatasa de tirosina PtpA, proteína que nuestro grupo demostró interacciona con proteínas humanas relacionadas al metabolismo. En este contexto, es relevante para el grupo obtener cepas micobacterianas que carezcan de dicho gen o que el mismo esté silenciado. Recientemente se ha aplicado con éxito la estrategia CRISPR-dCas9 interferente en la generación de cepas mutantes de micobacterias. Con este método se puede modular el nivel de expresión de un gen, insertando al genoma bacteriano un plásmido que contenga la secuencia de la proteína dCas9 y el sgRNA. La enzima dCas9 es incapaz de cortar la doble hebra de ADN debido a mutaciones en sus dominios nucleasa y se une al sgRNA, cuya secuencia fue diseñada de forma de que complemente y se hibride al gen que codifica para PtpA, formando un complejo que inhibe la transcripción de dicho gen. En el presente trabajo se aplicó dicha estrategia a Mycobacterium bovis BCG y Mycobacterium smegmatis, siendo exitosa para esta última micobacteria, ya que se detectó una reducción significativa de los niveles de PtpA en extractos proteicos bacterianos. A su vez, los resultados sugieren que en las condiciones de cultivo utilizadas en la tesis la PtpA de Mycobacterium smegmatis producida no se secreta ya que se detecta principalmente en los extractos celulares y no en el sobrenadante de los cultivos de Mycobacterium smegmatis.