Desarrollo de un sistema para estudiar la formación de G-quadruplex de ARN y su eventual rol en la interacción con la proteína supresora de tumores p53

Abstract

La proteína supresora de tumores p53 contribuye al mantenimiento de la homeostasis celular modulando respuestas a distintos tipos de estrés, como daño en el ADN, activación de oncogenes o estrés oxidativo, actuando principalmente como factor de transcripción. p53 posee dominios de unión a ADN y de transactivación que contribuyen con su capacidad de regular la expresión de genes vinculados a funciones celulares vitales, actividad afectada por muchísimas mutaciones descritas en cáncer. De hecho, TP53, el gen que codifica para p53, ha sido reconocido como el gen con mayor frecuencia de alteraciones somáticas en cáncer en humanos. En células humanas, el gen TP53 podría producir 12 isoformas de p53 con funciones biológicas específicas y no superpuestas, lo que contribuye a diversificar la función de p53 en respuesta a diferentes situaciones de estrés. En particular, la isoforma p47 carece de los primeros 39 aa de p53, quienes constituyen el dominio de transactivación I, en donde se encuentran importantes sitios de unión a proteínas que regulan su actividad transcripcional y su estabilidad. Llamativamente, la expresión de p47 se induce específicamente mediante mecanismos de inicio alternativo de la traducción independientes de la caperuza (5’Cap) durante la respuesta a proteínas desplegadas (UPR) activada para resolver el estrés en el retículo endoplásmico (RE). La UPR es una respuesta adaptativa desencadenada para restaurar la homeóstasis del RE cuando ocurre una acumulación excesiva de proteínas mal plegadas o agregadas en su lumen. Esto puede ocurrir en condiciones fisiológicas en células que sintetizan y secretan elevada cantidad de proteínas y también en situaciones patológicas dentro de las que se encuentran las enfermedades neurodegenerativas, el cáncer y la diabetes. En contexto de estrés en el RE, parece de particular relevancia la regulación post transcripcional por la vía p53. Se ha reportado que tanto p53 como p47 suprimen la traducción de p21, MDM2, MDMX y BiP, en algunos casos mediante interacción directa con los ARNm. Estas observaciones ilustran la capacidad de unión al ARN de p53, una propiedad mucho menos caracterizada que la de unión al ADN que media la función de p53 como regulador transcripcional. Datos no publicados del laboratorio sugieren que p53 controla la expresión de un conjunto amplio de ARNm de forma post-transcripcional en la UPR. Algunos de estos ARNm tienen en sus regiones 5’ no traducidas (5’UTRs) secuencias ricas en guaninas con potencial de formar G-quadruplex (G4). Los G4 son estructuras no canónicas de ácidos nucleicos implicadas en muchos procesos celulares esenciales como transcripción, splicing, ensamblaje de ribonucleoproteínas (RNPs), localización y traducción de ARNs. El enriquecimiento de estas secuencias en ARNm con expresión controlada por p53 permite plantear la hipótesis de que actúen como una plataforma de regulación, tal vez a través de interacciones directas con la proteína p53. Para estudiar eventuales interacciones entre p53 y G4 en ARNm, en este trabajo desarrollamos en paralelo las herramientas para identificar ARNm cercanos a p53 y su isoforma p47 durante la UPR en un modelo celular y desarrollamos un sistema in vitro para estudiar la formación de G4 en oligos de ARN. Los ARNs cercanos a p53 y p47 se identificarán por una aproximación de marcaje con la enzima ascorbato peroxidasa APEX2 acoplado a secuenciación masiva. Para ello, generamos construcciones de p53 fusionada a APEX2 y validamos su patrón de expresión y funcionalidad. En paralelo, determinamos in silico que las 5’UTRs de ARNm candidatos con posible regulación traduccional mediada por p53 tienen potencial para formar G4. Por último, generamos un sistema que nos permitió identificar la formación de ARN G4 in vitro, mediante una sonda fluorescente específica en electroforesis en gel de poliacrilamida.