Optimización de un sistema de RT-qPCR para la evaluación de la expresión génica en ovarios de ratonas

Abstract

El presente estudio se enfocó en la optimización de un sistema de RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa y cuantificación en tiempo real) para evaluar la expresión génica en ovarios de ratonas adultas jóvenes. La RT-qPCR es una técnica clave en biología molecular debido a su alta sensibilidad y especificidad para cuantificar niveles de ARN mensajero (ARNm). Sin embargo, la precisión de los resultados obtenidos mediante esta técnica depende de varios factores, como la calidad del ARN extraído, las condiciones de la reacción y la eficiencia de los cebadores. Este trabajo tuvo como objetivo identificar y optimizar dichos factores para garantizar resultados confiables y reproducibles. Se evaluaron pares de cebadores específicos para genes implicados en la supervivencia y muerte celular, como BAX, BCL2 y CASP3, a ser probados en muestras de ovario de animales expuestos a diferentes tratamientos. La evaluación incluyó análisis in silico y experimentales, considerando criterios como la longitud de los cebadores y del producto de amplificación, el contenido de GC, la ausencia de estructuras secundarias y la localización de los cebadores en el gen. La mayoría de los cebadores evaluados cumplió con los criterios esperados. Se optimizó el protocolo de extracción de ARN a partir de tejido ovárico y se evaluó tanto la calidad como la cantidad del ARN obtenido, logrando un material de alta calidad, adecuado para su uso en RT-qPCR. Asimismo, se evaluaron distintas temperaturas de desnaturalización y concentraciones de cebadores, determinando las condiciones óptimas para este sistema. Para verificar la eficiencia de los cebadores, se realizaron curvas estándar, obteniéndose eficiencias de amplificación aceptables. Los resultados preliminares de la cuantificación de la expresión génica en el ovario indicaron que los cebadores diseñados para los genes seleccionados eran funcionales. Sin embargo, las eficiencias inicialmente obtenidas no pudieron ser reproducidas en otros individuos, y debido a un muestreo limitado y a que algunos cebadores no funcionaron como se esperaba, no fue posible realizar evaluaciones concluyentes sobre los efectos del tratamiento. Esto llevó a la necesidad de diseñar cebadores nuevos, que serán probados en una siguiente etapa.