Generación de herramientas biotecnológicas para análisis de glicanos biológicos

Abstract

Los glicanos biológicos se encuentran unidos a proteínas o lípidos y desempeñan diversas funciones tanto fisiológicas como patológicas en los seres vivos. Las enzimas activas en carbohidratos, como las glicosiltransferasas y las glicosil hidrolasas, son fundamentales para la síntesis, modificación y degradación de los glicanos complejos. En particular, las α-manosidasas y α-fucosidasas son ejemplos de glicosidasas con la habilidad para hidrolizar enlaces específicos en los glicanos. El estudio de estas enzimas y su aplicación en glicobiología son importantes para comprender la estructura y función de los glicanos, lo que puede tener implicancias en el desarrollo de diagnósticos y tratamientos terapéuticos de patologías mediadas por interacciones glicano-proteínas. En esta tesis se llevó a cabo un screening para identificar actividad α-manosidasa y α- fucosidasa en microorganismos autóctonos. Se encontró actividad α-manosidasa en bacterias, levaduras y hongos filamentosos y actividad α-fucosidasa en levaduras y hongos filamentosos. Se seleccionó la bacteria Bacillus sp. 12.22 y el hongo filamentoso Dichostereum sordulentum DS-1488 para evaluar las mejores condiciones para la producción, purificación y caracterización de una α-manosidasa y α-fucosidasa respectivamente. Se purificó y caracterizó la α-fucosidasa del hongo Dichostereum sordulentum DS-1488 con un grado significativo de pureza, aunque a expensas de bajos rendimientos. Se trata de una proteína homodimérica con un peso molecular de 214 kDa, un pH óptimo de 4.0 y una temperatura óptima de 70 ºC. Su KM es 0.27 mM y su VMax de 3,3 μmoles de PNP/min x mg para el sustrato p-nitrofenil α-L-fucopiranósido, determinada a pH 4.0 y 37ºC. La misma presenta inhibición por sustrato. Por otra parte, se estudió la purificación de la enzima α-manosidasa de Bacillus sp. 12.22. Sin embargo, la pérdida de actividad enzimática durante el proceso de purificación no permitió continuar trabajando con la misma. Como alternativa se seleccionó una α- manosidasa extracelular del hongo Aspergillus terreus BFQU 121. Se evaluaron las mejores condiciones de crecimiento de cultivo para maximizar la producción de la enzima a los efectos de continuar trabajando en su purificación en futuras etapas. Este trabajo contribuyó a la identificación de nuevas enzimas con potencial aplicación en el análisis del rol biológico de los glicanos en las glicoproteínas.