Estudio teórico-experimental de los mecanismos moleculares que evitan la extrusión celular apical durante el proceso de neurulación primaria

Abstract

Durante la neurulación primaria, el neuroectodermo pseudoestratificado inicialmente plano del embrión amniota se pliega y se fusiona, dando forma al tubo neural. Este fenómeno complejo (y todavía no bien comprendido) involucra cambios morfológicos y contribuciones mecánicas tanto del neuroectodermo como de los tejidos adyacentes. Podemos intentar entender las condiciones mecánicas que permiten el plegado normal estudiando las condiciones en las que este proceso falla. Por ejemplo, la activación farmacológica via PMA de la quinasa PKC produce defectos inusuales: la falla del cierre del tubo neural, la alteración de la polaridad apico-basal, y la eliminación de células de la monocapa hacia el lado apical. Este último fenómeno, denominado extrusión celular, suele clasificarse dependiendo de si la célula eliminada está destinada a la muerte celular por apoptosis (extrusión apoptótica) o no (extrusión viva), y no ocurre normalmente en este sistema. Resultados previos indicaron que la extrusión observada podría ser de este último tipo, y que su origen podría deberse a la acción de MARCKS, una proteína capaz de vincular la membrana con la corteza celular, sugiriendo una causa principalmente mecánica para la misma. Con el objetivo de comprender el origen de la extrusión celular emprendimos una aproximación doble, realizando experimentos farmacológicos sobre embriones de pollo cultivados, utilizando PMA y el inhibidor de la apoptosis QVD-OPh, y también experimentos in silico con un modelo mecánico que adaptamos buscando representar la morfología de los epitelios pseudoestratificados. En nuestros experimentos farmacológicos tanto el tratamiento con PMA como el tratamiento doble con PMA y QVD-OPh generaron extrusión apical generalizada y alteraron la distribución normal de MARCKS, así como de los marcadores apicales ɣ-tubulina y ZO-1, que se volvieron más dispersos y menos polarizados, particularmente entre las células extruidas. En los embriones tratados con PMA fue posible encontrar células extruidas conteniendo la forma activada de Caspasa-3 (un marcador de apoptosis), que presentaron en general un aspecto anormal, diferenciándose de la mayoría de las células extruidas. No fue posible encontrar células así marcadas en los embriones que fueron tratados con PMA y QVD-Oph. En las simulaciones computacionales se observó extrusión generalizada en tejidos con altas densidades nucleares, que pudo ser prevenida al introducir fuerzas que normalmente no son consideradas a la hora de modelar epitelios, relacionadas en nuestro caso con la distinción entre el lado apical y basal. Bajo estas condiciones se obtuvieron morfologías similares a la pseudoestratificada, con células columnarizadas cuya forma se ajusta a la distribución de núcleos rígidos. Como caso particular, mostramos que las simulaciones inicializadas con un grupo de células con núcleos localizados basalmente flanqueadas por un tejido sin núcleos dan como resultado un epitelio establemente plegado, pasando por estados semejantes a los observados en la neurulación primaria. En conjunto, podemos afirmar que los diversos defectos inducidos por el tratamiento con PMA son independientes de la apoptosis, y que la extrusión apical así inducida es un ejemplo de extrusión viva, posiblemente causada por una inestabilidad mecánica que en situación normal sería prevenida por mecanismos relacionados con el establecimiento de la polaridad apico-basal de las células del epitelio. Además, nuestros resultados sugieren que estos mecanismos coinciden con aquellos que dan su característica morfología pseudoestratificada al neuroepitelio durante la neurulación primaria, y que difieren con respecto a los que dominan el estado mecánico de otros epitelios.