Caracterización y consecuencias funcionales de las modificaciones postraduccionales de la aconitasa mitocondrial humana

Abstract

La aconitasa mitocondrial (ACO2) es una enzima del ciclo de Krebs que cataliza la isomerización reversible de citrato a isocitrato mediante un intermediario cis-aconitato. Esta enzima posee un centro ferrosulfurado [4Fe-4S]2+ en su sitio activo que es esencial para la catálisis y que además ha sido identificado como uno de los principales blancos de las especies reactivas del oxígeno y el nitrógeno. La ACO2 es preferencialmente modificada e inactivada por oxidantes durante el envejecimiento y durante patologías que cursan con disfunción mitocondrial. Además, dado que la inactivación por oxidantes puede ser reversible, se la ha postulado como un sensor redox. Hasta el inicio de esta tesis, no había reportes realizados con la ACO2 humana, por lo que este trabajo abordó como objetivos generales expresar, purificar y realizar la caracterización bioquímica, funcional y estructural de la ACO2 humana, además de investigar algunas de sus funciones esenciales a nivel celular, tales como su papel modulador en el metabolismo y su función como sensor redox mitocondrial. Se obtuvo la ACO2 humana recombinante con un alto nivel de pureza (> 99%) que presentó un pH óptimo de 8.5, en concordancia con el pH alcalino de la matriz mitocondrial. La actividad enzimática aumentó gradualmente a medida que se aumentó la temperatura hasta alcanzar los 50 °C, sin embargo, a temperaturas superiores, la ACO2 mostró signos de agregación. Se determinaron las KM para los tres sustratos de la enzima: 950 ± 90 μM para el citrato, 100 ± 10 μM para el isocitrato y 7.9 ± 0.7 μM para el cis-aconitato. Se calcularon las constantes de reacción de segundo orden de la ACO2 humana con peróxido de hidrógeno, peroxinitrito, radical carbonato y superóxido, obteniendo constantes del orden de 102, 105, 108 y 108 M-1s-1, respectivamente, en el orden de los reportados previamente para otras especies, verificando la alta sensibilidad de la ACO2 a oxidantes. La inactivación de la ACO2 humana con estos oxidantes fue reversible bajo condiciones anaerobias tras la incubación con hierro, azufre y un agente reductor. Se identificaron diferencias significativas respecto a la temperatura de melting (Tm), de la [4Fe-4S]2+-ACO2 activa, respecto a la [3Fe-4S]+-ACO2 inactivada oxidativamente (51.1 ± 0.5 y 43.6 ± 0.2 ᵒC respectivamente), brindando evidencia de cambios estructurales, o cambios en el desplegado de la enzima. Estos dos estados también mostraron diferencias respecto a la exposición de parches hidrofóbicos, evidenciado por el aumento en la intensidad de fluorescencia de la sonda ANS al incubarse con la [3Fe-4S]+-ACO2, respecto a la [4Fe-4S]2+-ACO2. Se desarrollaron parámetros para los centros ferrosulfurados de la ACO2 que permitieron la realización de simulaciones de dinámica molecular para evaluar las diferencias entre los estados del centro Fe-S de la ACO2, encontrándose que la [3Fe-4S]+-ACO2 inactiva posee un mayor nivel de apertura y exposición del centro ferrosulfurado, en conjunto con una dinámica global de la proteína de tipo breathing, de mayor magnitud para el estado inactivo. Se evaluó el impacto de la acetilación por acetil-CoA en la ACO2 humana, encontrándose que esta modificación llevó a una pérdida de la actividad de la ACO2 (hasta un 30% tras la incubación con 1.5 mM acetil-CoA). Las lisinas acetiladas que presentaron una modificación dosis-respuesta respecto a la concentración de acetil-CoA fueron la 86, 401, 458, 462 y 776. Por otra parte, la 138, 245, 520, 628 y 651-652 (el mismo péptido), fueron detectadas en niveles similares para todas las concentraciones de acetil-CoA. Se obtuvo numerosa evidencia sobre la existencia de la interacción física entre la ACO2 humana y la frataxina humana (FXN), proteína participante de la biosíntesis de novo de centros ferrosulfurados en la mitocondria. Se mostró que la FXN recombinante cargada con hierro es capaz de activar a la ACO2, incluso cuando la misma resulta previamente inactivada por peroxinitrito. Adicionalmente, mediante experimentos de fluorescencia intrínseca, ELISA de interacción proteína-proteína y anisotropía de fluorescencia, se confirmó la interacción física hierro dependiente entre ambas proteínas. Esto fue complementado mediante estudios in silico, donde se generaron modelos del complejo ACO2-FXN mediante AlphaFold2.0-Multimer, y mediante docking utilizando el webserver HADDOCK 2.0. Estos estudios sugirieron que la interacción entre la ACO2 y la FXN se encuentra sustentada en la coevolución entre ambas proteínas, así como también, se obtuvieron modelos que acercan lo suficiente el centro ferrosulfurado inactivo de la ACO2 y la región ácida de la FXN (la cual tiene asignado el rol de unión a hierro) para sustentar un mecanismo de transferencia de hierro. Nuestros resultados apoyan que la FXN además de participar en la biosíntesis de centros Fe-S en la mitocondria, participaría en la reactivación de la ACO2 oxidada. Además, se estudió la actividad aconitasa en modelos celulares que cursan con un aumento en la producción de oxidantes endógenos: 1) un modelo de senescencia celular inducida por el oncogén RAS, y 2) células espermáticas que transcurren el proceso de capacitación. Se logró determinar en ambos casos, el aumento de los niveles de superóxido mitocondrial en estado estacionario, en comparación con los controles, evaluando la actividad y expresión de la ACO2. En el modelo de senescencia inducida por el oncogén RAS, la inhibición de la ACO2 se acompañó por cambios en metabolitos y enzimas que confirman un redireccionamiento del citrato desde la mitocondria hacia el citosol. Esto se acompaña con una disminución en la biosíntesis de ácidos grasos y un aumento en la actividad de la SIRT6, sugiriendo que el aumento en los niveles de citrato impactará en la acetilación proteica en este caso. Por otra parte, la evaluación de la ACO2 en espermatozoides humanos permitió confirmar que la producción de especies oxidantes mitocondriales es esencial para el proceso de capacitación espermática. Durante este proceso, la síntesis de ATP y la respiración mitocondrial se encuentran aumentadas a pesar de la inhibición de la ACO2, sustentando que la ACO2 no ejerce un control metabólico en estas células. En resumen, este estudio proporciona una visión integral de la ACO2 humana desde su expresión y purificación, su caracterización estructural, funcional e interacción con proteínas mitocondriales asociadas y su papel potencial en la modulación del metabolismo mitocondrial.