Evaluación del rol de mutantes de la fosfatasa OH1 del virus Orf en la translocación al núcleo del factor de transcripción STAT1

Abstract

El virus Orf (ORFV) es una especie de virus perteneciente al género Parapoxvirus dentro de la familia Poxviridae y es el agente causante de la enfermedad zoonótica denominada Ectima Contagioso. Esta enfermedad se da en ovinos y caprinos a una edad temprana y puede ser transmitida a seres humanos que estén en contacto con animales infectados. Los ORFV se caracterizan por ser capaces de codificar una gran cantidad de proteínas moduladoras de la respuesta inmune de la célula hospedera. Uno de estos factores de virulencia es OH1, una fosfatasa de tirosina de doble especificidad. En estudios previos del grupo de investigación, se determinó la estructura cristalográfica de OH1 y se identificó a STAT1 como su sustrato fisiológico. Además, se observó una disminución en los niveles de STAT1 fosforilado en células transfectadas con el gen de OH1, lo que indicó que la expresión de esta fosfatasa afecta la vía de señalización JAK-STAT y bloquea la translocación de STAT1 al núcleo. A partir de estos resultados, junto con estudios in silico, se propuso un mecanismo de interacción en dos pasos entre OH1 y STAT1, que involucra a la Tyr152 de la fosfatasa viral. Este trabajo busca contribuir al estudio de este mecanismo de interacción mediante la evaluación de la localización subcelular de STAT1 en células HeLa transfectadas con diferentes mutantes de OH1. Para cumplir con este objetivo se produjeron los vectores plasmídicos portadores del gen de OH1 salvaje y los diferentes mutantes. Estos plásmidos fueron producidos y verificados mediante electroforesis en gel de agarosa y secuenciación. Posteriormente se optimizó el ensayo de transfección en células HeLa inducidas con IFN-γ, para luego realizar los ensayos empleando los diferentes mutantes de OH1 y evaluar la localización subcelular de STAT1 mediante detección por inmunofluorescencia. Se observó una disminución en la localización nuclear de STAT1 en las células transfectadas con el plásmido que expresa la fosfatasa salvaje (OH1WT) y su variante inactiva (OH1C112S), en comparación con las células transfectadas con el plásmido control que no porta el gen de la fosfatasa. Estos resultados confirman lo previamente observado por el grupo respecto a OH1WT y OH1C112S, indicando que ambas variantes inhiben la translocación de STAT1 al núcleo. Por otro lado, los ensayos realizados con el mutante de OH1 en la Tyr152 (OH1Y152F) en el cual la translocación de STAT1 al núcleo no se ve afectada, refuerzan nuestra hipótesis de que la interacción entre OH1 y STAT1 se inicia en un sitio diferente al sitio activo de la fosfatasa involucrando el residuo Tyr152.