Entendiendo las bases de la enfermedade de Parkinson: caracterización de células neurotóxicas asociadas con neurodegeneración dopaminérgica in vivo

Abstract

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la degeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra (SN), causando una disminución de la dopamina en el caudado-putamen. La etiología de la EP es desconocida para la mayoría de los casos y los tratamientos clínicos disponibles son sintomáticos y presentan efectos secundarios adversos. Aunque desde hace varias décadas se reconoce la importancia de la glía reactiva neuroinflamatoria en la muerte neuronal, las evidencias que muestran claramente el papel de las células gliales en la patogénesis de la EP son limitadas. Para contribuir con esta temática, nuestro grupo de investigación comenzó a investigar la capacidad neurotóxica de células gliales obtenidas de la SN de ratas inyectadas unilateralmente con la toxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA), un modelo experimental de EP ampliamente validado. A partir de estos animales, se lograron aislar células de la SN que proliferaron en cultivo y que, en estudios preliminares, mostraron ser capaces de inducir degeneración de neuronas dopaminérgicas cuando son inyectadas en la SN de animales control. Este hallazgo sugiere que la glía obtenida del ambiente degenerativo de la SN podría tener propiedades neurotóxicas. Por este motivo, profundizar en el conocimiento de la biología de esta glía reactiva derivada del daño (GRDD) y sobre sus particularidades podría contribuir a un mejor entendimiento de las bases fisiopatológicas de la EP. En este contexto, este trabajo pretende aportar evidencias a la hipótesis que predice que las células gliales desempeñan un rol significativo en la patogénesis de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la EP. En forma más específica, el objetivo fue aportar conocimiento sobre las características de estas células con propiedades neurotóxicas y completar la caracterización del novedoso modelo de EP inducido por la inyección de células gliales obtenidas del entorno dañado por 6-OHDA. Para ello, inyectamos unilateralmente 6-OHDA en la SN de ratas adultas mediante cirugía estereotáxica y luego de tres días, diseccionamos el tejido de la SN para obtener un cultivo primario de GRDD a partir de estos animales. En conjunto, también se cultivaron muestras del cuerpo estriado (CE) y el hipocampo (Hc) para evaluar la producción de GRDD en otras regiones, eligiendo al CE por estar estrechamente asociada a la SN y el Hc como región control. De esta forma se obtuvieron dos tipos de cultivos a partir de cada región: uno proveniente del lado inyectado con la toxina o ipsilateral y otro del lado no tratado o contralateral. Posteriormente, se precedió a la caracterización de las células obtenidas en cultivo mediante inmunocitoquímica y otros métodos de tinción para evaluar aspectos como: número de células, tamaño e inmunorreactividad a diferentes marcadores celulares para determinar su fenotipo. Por otro lado, estudiamos el potencial neurotóxico de la GRDD, tanto in vitro al cocultivarlas con células PC12, como in vivo inyectándolas unilateralmente en la SN de ratas control y analizando la integridad de la vía nigroestriatal a los 30 días del tratamiento mediante inmunohistoquímica contra tirosina hidroxilasa y tests comportamentales para evaluar el rendimiento motor. Nuestros resultados de los estudios in vitro muestran que, el número de células obtenidas del entorno degenerativo de la SN fue significativamente mayor en comparación con el lado de control (contralateral). Interesantemente, el rendimiento de los cultivos del CE ipsilateral a la inyección de 6-OHDA también fue mayor comparado con el lado contralateral y con el Hc de ambos lados, aunque el número de células obtenidas fue menor que el obtenido de la SN. A su vez, estas células tienden a ser de mayor tamaño tanto en la SN como en el CE. Esto es esperable ya que al momento del cultivo la inflamación es superior en el sitio de inyección de la toxina y esto podría ser la causa de la mayor presencia de glía reactiva. La población glial residente se encuentra exacerbada en el sitio donde la neurodegeneración es mayor, en este caso la SN, pero también a nivel del CE donde se encuentran las terminales dopaminérgicas degenerantes, aunque en menor medida. Por otro lado, los estudios sobre el fenotipo de la GRDD obtenida a partir de la SN tratada con la toxina, indican que son positivas tanto para marcadores de astrocitos como para marcadores de microglía. Esta característica es particularmente sorprendente porque rara vez se observa un fenotipo mixto o híbrido de este tipo y podría ser indicativo de que la GRDD posee características de ambos tipos de células gliales. Se ha observado que este fenómeno puede ocurrir en ciertas condiciones fisiológicas o patológicas, como durante la inflamación, en tumores o en respuesta a lesiones cerebrales y podría estar explicando en parte los mecanismos moleculares que le confieren las propiedades particulares. Finalmente, los experimentos sobre el potencial neurotóxico mostraron que la GRDD produce una reducción en la viabilidad de células PC12 en cocultivo y en los experimentos in vivo, su inyección en la SN de animales control fue suficiente para provocar la degeneración ipsilateral de la vía nigroestriatal en comparación al lado contralateral y a tratamientos control como la inyección de glía mixta normal o vehículo. Esto es indicativo de que las células gliales extraídas del ambiente degenerativo expresan un fenotipo que las aleja de sus funciones homeostáticas clásicas, generando una ganancia de funciones neurotóxicas que por sí solas son capaces de producir muerte neuronal. En conjunto, estos hallazgos contribuyen a una mejor comprensión de las bases fisiopatológicas de la EP, evidenciando un vínculo directo entre disfunción glial con neurodegeneración y posicionando a la modulación de estas células gliales neurotóxicas como una posible diana terapéutica novedosa y atractiva.