Abordando el estudio de la interacción entre la fosfatasa OH1 del virus Orf y el factor de transcripción STAT1

Abstract

El virus Orf es el causante del ectima contagioso, una enfermedad global que afecta al ganado ovino y caprino. Este virus tiene un genoma de ADN de doble cadena y pertenece al género Parapoxvirus de la familia Poxviridae. Los virus de esta familia desarrollan diversas estrategias para infectar a los huéspedes y evadir sus defensas. Una de estas estrategias consiste en interferir con la vía de señalización JAK-STAT, desfosforilando el factor de transcripción STAT1 en la Tyr701, bloqueando así la respuesta antiviral mediada por interferón. En estudios previos de nuestro grupo, se llevó a cabo la caracterización estructural y bioquímica de la fosfatasa de tirosina OH1 del virus Orf, y se demostró su interacción y actividad con STAT1. Asimismo, nuestro grupo propuso, basados en resultados experimentales in silico, la hipótesis de que en una primera etapa, la fosfatasa viral OH1 recluta a STAT1 a través de la Tyr152, para luego, en una segunda etapa, desfosforilar la Tyr701 de STAT1, bloqueando así su dimerización e importación al núcleo. En esta tesis, se buscó avanzar en entender el mecanismo de reclutamiento del sustrato STAT1 por parte de la fosfatasa viral OH1. Para ello, se produjo de forma recombinante la forma salvaje de OH1 (OH1WT) y mutantes relevantes para la dimerización (OH1C15S), la actividad (OH1C112S) y para el reclutamiento de STAT1 (OH1Y151F y OH1Y152F). Se caracterizó la actividad fosfatasa de estas variantes de OH1 utilizando un sustrato artificial no proteico de fosfatasas. Así, se confirmó la actividad fosfatasa de la OH1WT y la ausencia de esta para el mutante en la cisteína catalítica OH1C112S. Además, se observó que OH1C15S, mutante en la cisteína responsable de estabilizar el dímero de OH1 mediante un puente disulfuro, presentó una disminución considerable en la actividad respecto a OH1WT. Este resultado difiere de lo que se observó en un lote anterior producido en nuestro laboratorio, en el cual no se detectó pérdida de actividad. Esto seguramente se debió a problemas en la purificación de este nuevo lote, aspecto que se discute en la tesis. Los mutantes OH1Y151F y OH1Y152F también mostraron una importante reducción de la actividad comparada con OH1WT (>75 %). Este resultado no fue el esperado, ya que la actividad se evaluó con un sustrato pequeño y no proteico, el cual interactúa directamente a través del sitio activo de las fosfatasas, y no es reclutado como lo sería STAT1 por un sitio diferente. Sin embargo, no se descarta que la pérdida en la actividad se deba al cambio de aminoácido o a la calidad de la proteína recombinante producida, por lo cual se deberán evaluar nuevos lotes. Posteriormente, se realizaron ensayos celulares en el modelo HeLa, donde se evaluó el efecto de la expresión de la OH1 y sus variantes en la importación de STAT1 al núcleo. Ensayos previos del grupo mostraron que la expresión de OH1WT y del mutante inactivo OH1C112S afectan la importación de STAT1 al núcleo, esto respalda la hipótesis planteada de reclutamiento de STAT1 por un sitio diferente al sitio activo. En los ensayos celulares realizados en la presente tesis, se reprodujo el efecto observado para el mutante inactivo (OH1C112S), detectándose una disminución de la importación nuclear de STAT1, pero para la OH1WT la tendencia observada no fue significativa. Por otro lado, en este trabajo se evaluó por primera vez el efecto de la expresión de los mutantes OH1Y151F y OH1Y152F, observándose que estos no afectaron la importación nuclear de STAT1. Este último resultado apoya la hipótesis de interacción propuesta por el grupo. No obstante, debido a la discrepancia en los resultados obtenidos para la expresión de la OH1WT y a la necesidad de un mayor número de réplicas, las conclusiones que se pueden sacar son limitadas.