Estudio de causa y patogenia en un tipo de azoospermia no obstructiva humana empleando ratones con genoma editado

Abstract

La infertilidad es un problema que afecta a una considerable proporción de parejas en edad reproductiva, con una incidencia del 10-15%. Tanto los trastornos masculinos como los femeninos contribuyen a esta condición, y aproximadamente el 25% de los casos se clasifican como infertilidad idiopática debido a que su causa aún no ha sido identificada. En muchos casos, los errores durante la etapa meiótica parecen estar relacionados con la infertilidad idiopática tanto en hombres como en mujeres. Un componente crucial durante la profase I meiótica es el complejo sinaptonémico (CS), una estructura proteica en forma de escalera que se forma entre los cromosomas homólogos. El CS desempeña un papel fundamental en el apareamiento de los cromosomas homólogos, y facilita la recombinación meiótica. En estudios con pacientes infértiles se han identificado mutaciones en genes que codifican componentes del CS, lo que ha llevado a la hipótesis de que estas mutaciones podrían ser responsables del fenotipo infértil observado en estos individuos. Utilizando la tecnología CRISPR/Cas9, hemos generado líneas de ratones modificados genéticamente que portan mutaciones equivalentes a las encontradas en pacientes infértiles, específicamente en el gen Syce1, codificante de un componente de elemento central del CS. Estos modelos murinos humanizados han sido cruciales para establecer una conexión entre casos de infertilidad humana y mutaciones específicas en el CS. En el desarrollo de esta tesis, se caracterizó una línea murina conteniendo una mutación que afecta el sitio aceptor de splicing del intrón 3-4 del gen Syce1, equivalente a una asociada a casos de azoospermia no obstructiva en humanos. Entre los resultados más relevantes con respecto a la posible relación causal entre la mutación en estudio y el fenotipo infértil, los ratones homocigotos para la mutación no pudieron tener descendencia en los ensayos de fertilidad realizados. Asimismo, se encontraron diferencias significativas en el tamaño y contenido celular de las gónadas en comparación con las de los ratones heterocigotos y los ratones control. El análisis histológico reveló cambios evidentes en la morfometría de los túbulos seminíferos, y un epitelio seminífero con espermatogénesis incompleta, con ausencia de células en fase posmeiótica (espermiogénesis). El análisis mediante citometría de flujo confirmó la ausencia de poblaciones celulares posmeióticas con contenido de ADN=C en los mutantes homocigotos. Estos resultados permitieron demostrar que la sola presencia bialélica de la mutación en el genoma del ratón, es suficiente para provocar azoospermia no obstructiva. Con relación a los mecanismos que subyacen la enfermedad, los ensayos de inmunofluorescencia de los componentes del CS en los testículos adultos de los ratones mutantes homocigotos revelaron defectos meióticos, alteraciones en la sinapsis cromosómica y en el ensamblaje del CS. No se detectó en estos mutantes la presencia de proteína SYCE1 ni de otras proteínas que normalmente se cargan en el CS luego de la incorporación de SYCE1. Además, la cuantificación de los niveles de transcripto del gen Syce1 en los testículos adultos mostró niveles significativamente menores en los ratones mutantes homocigotos que en los wild type (WT) y niveles intermedios en los ratones heterocigotos, lo que sugiere la degradación de los transcriptos anómalos de Syce1. En conclusión, estos resultados respaldan de manera sólida el papel causal de esta mutación en la azoospermia no obstructiva en pacientes masculinos, y sugieren que los mecanismos involucrados están relacionados con defectos en la sinapsis cromosómica resultantes de la ausencia de SYCE1.