Identificación de actores moleculares involucrados en la interacción entre ß-rizobios y leguminosas hospederas

Abstract

Los rizobios son bacterias del suelo pertenecientes a las subdivisiones alfa y beta de proteobacterias, las cuales se caracterizan por asociaciarse simbióticamente con plantas de la familia Fabaceae. Esta asociación requiere un complejo diálogo molecular entre los simbiontes, el cual implica mecanismos de señalización y mutuo reconocimiento, culminando con la formación de nódulos en las raíces de las plantas, donde las bacterias llevarán a cabo la fijación biológica del nitrógeno. Este diálogo ocurre en la rizósfera, donde la planta, a través de sus raíces libera una gran diversidad de moléculas entre las que se encuentran carbohidratos, ácidos orgánicos y compuestos aromáticos. En dicho contexto, los flavonoides como la luteolina son moléculas clave durante los primeros pasos de la simbiosis rizobio-leguminosa, las cuales al ser secretadas por la planta son capaces de inducir la transcripción de los genes nod bacterianos, responsables de la síntesis y secreción de moléculas lipo-quito-oligosácaridos (LCOs) claves para el reconocimiento de la planta huésped. Actualmente, el conocimiento acerca de este proceso proviene mayoritariamente de modelos de estudios, donde se utilizan los alfa- rizobios, desconociéndose en gran medida lo que ocurre durante la interacción entre beta-rizobios y sus leguminosas hospederas. En este trabajo se utilizó como modelo de estudio un beta-rizobio, Cupriavidus necator UYPR2.512 y su par simbionte, Mimosa pudica. Primeramente, con el objetivo de conocer las respuestas moleculares de UYPR2.512 en los primeros pasos de la interacción simbiótica, se utilizó la luteolina como inductor de los genes nod. Con este fin, se decidió (i) re-secuenciar y mejorar la anotación del genoma de UYPR2.512, (ii) estudiar el efecto de la luteolina en la expresión de los genes nod bacterianos, (iii) describir las capacidades de interaccionar con el hospedero de UYPR2.512 a nivel genómico, (iv) estudiar la respuesta de la bacteria a la presencia de luteolina, utilizando como herramienta el RNA-Seq y (v) caracterizar las moléculas involucradas en la señalización de la interacción simbiótica, mediante una aproximación metabolómica. La secuenciación de UYPR2.512 mostró la existencia de un genoma compuesto de 9,8Mb, incluyendo 4 replicones circulares: dos cromosomas y dos plásmidos mayores a 300 Kb, uno de ellos conteniendo los genes simbióticos nod, nif y fix. Además, se identificaron genes implicados en la interacción con el hospedero (genes simbióticos, genes relacionados con sistemas de secreción, degradación de compuestos aromáticos, homeostasis de metales, entre otros). Por otro lado, se evaluó la respuesta de los genes nod bacterianos a la presencia de luteolina en UYPR2.512 portando el plásmido pCBM01 (pnodB19424-lacZ), indicando que la luteolina es una molécula señal fuerte y altamente específica en este beta-rizobio. Mediante el RNA-Seq se observó un total de 145 genes expresados diferencialmente, con un número similar de genes sub-expresados y sobre-expresados, y una distribución particular entre los replicones. La mayoría de los genes sub-expresados se asignaron al cromosoma principal (chr1), mientras que los genes sobre-expresados se distribuyeron entre el resto de las moléculas (chr2, pCne512e o pSym, pCne512b). Los genes sobreexpresados incluyeron el operón nod, y genes implicados en la biosíntesis de exopolisacáridos y flagelos, así como también genes implicados en el metabolismo del cobre y otros metales. Entre los genes reprimidos se identificaron genes implicados en el metabolismo global del nitrógeno y del carbono. Estos resultados obtenidos sugieren que, en respuesta a la luteolina, UYPR2.512 no solo produce NFs, sino que también es capaz de remodelar su superficie y alterar su metabolismo con el fin de prepararse para la próxima interacción simbiótica con la planta huésped. Mediante varias técnicas de metabolómica no dirigida se intentó caracterizar las moléculas presentes en exudados radiculares de plántulas de Mimosa púdica. A partir de LC-ESI-MS/MS en exudados radiculares de plántulas de Mimosa pudica, se lograron detectaron 13 compuestos presentes únicamente en presencia del simbionte bacteriano, indicando la especificidad de dicha interacción. En esta línea, debido a que estos compuestos no fueron encontrados en las bases de datos disponibles hasta el momento, y sumado a la poca información sobre este modelo, se sugiere que estas moléculas expresadas diferencialmente podrán ser compuestos potencialmente desconocidos. Se comprobó que otros flavonoides como crisina, apigenina, ácido cumárico y la miricetina, además de la luteolina, pueden activar los genes nod en UYPR2.512, lo que confirma su papel como señales importantes en los primeros pasos de la interacción con sus hospederos. Aunque no se encontraron flavonoides específicos en los exudados de la planta Mimosa pudica, se identificaron otras moléculas que podrían estar involucradas en la interacción, como aminoácidos, ácidos aromáticos, carboxilatos y polialcoholes. La variación en la composición química de los exudados radiculares de la planta en respuesta a la presencia de UYPR2.512 refleja la complejidad de esta interacción. El uso combinado de las ciencias ómicas diversas, como la genómica, transcriptómica y metabolómica, nos permitió proponer un modelo de simbiosis entre los beta-rizobios y las leguminosas, confirmando la especificidad molecular de esta relación y abriendo nuevas perspectivas en la comprensión de las simbiosis entre microorganismos y plantas.