Anticuerpos monodominio fusionados a la luciferasa NanoLuc para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y alergias

Abstract

En esta tesis se exploró el potencial de generar proteínas quiméricas, formadas por nanobodies unidos a la enzima NanoLuc, para su uso como reactivos de detección en inmunoensayos. NanoLuc deriva de una luciferasa obtenida del camarón Oplophorus gracilirostris, que fue optimizada para su uso en aplicaciones biotecnológicas. La enzima resultante es de pequeño tamaño (19 kDa) y se destaca por generar mayores niveles de señal, además de poseer una buena estabilidad y presentar un alto nivel de expresión en Escherichia coli. Por estos motivos, resultó atractivo explorar su uso como estrategia para potenciar la sensibilidad de inmunoensayos. Inicialmente, utilizando un nanobody modelo se puso a punto la metodología para la producción y medición de actividad de las quimeras. Seguidamente, se aplicó esta estrategia al desarrollo de un inmunoensayo para la detección de la proteína de nucleocápside (proteína N) del virus SARS-CoV-2, el principal antígeno utilizado en el diagnóstico de esta infección. Esto incluyó la selección de un par optimizado de nanobodies contra esta proteína, los cuales fueron implementados en un ELISA en formato sándwich para la detección del antígeno en muestras de hisopado nasofaríngeo. El test desarrollado mostró una excelente especificidad y una muy alta sensibilidad. En comparación con el formato colorimétrico, la quimera nanobody- NanoLuc mostró ser un importante factor para lograr un sustancial aumento de la sensibilidad diagnóstica. Dada la capacidad reportera intrínseca de las quimeras, se pasó luego a utilizarlas como método de screening masivo de nanobodies. Como modelo, se utilizó la detección de la IgE humana, cuya cuantificación en suero posee gran relevancia a nivel clínico. Luego de la selección de un nanobody de alta afinidad para la captura, se utilizó el inmunocomplejo entre este nanobody y la IgE para aislar mediante panning potenciales nanobodies de detección. Los genes de los nanobodies seleccionados se combinaron en masa con el gen de NanoLuc, dando lugar a una biblioteca de expresión de quimeras que se usó para seleccionar, empíricamente y en gran escala, los nanobodies de detección en su formato final. Esta estrategia mostró un gran potencial, y dio lugar a la selección de seis clones de alta afinidad capaces de detectar la IgE humana con alta sensibilidad. Sin embargo, debido a la sobre-representación de nanobodies de alta afinidad, la biblioteca anti-IgE utilizada no resultó óptima como modelo para la evaluación del nuevo método de screening.