Estrategias para adaptar inmunoensayos de detección de pequeñas moléculas a formatos luminiscentes

Abstract

Los inmunoensayos son un conjunto de técnicas que se utilizan para identificar y cuantificar un determinado analito presente en una muestra. Estas técnicas se basan en la gran especificidad y afinidad de los anticuerpos por sus antígenos específicos. Según su diseño, se pueden clasificar en dos tipos: competitivos y no-competitivos. En los inmunoensayos no-competitivos, los anticuerpos se utilizan en exceso, de forma que se maximiza la sensibilidad del ensayo. Sin embargo, los analitos de bajo peso molecular no pueden ser detectados mediante estos ensayos dado que carecen de la capacidad de unir dos anticuerpos en simultaneo. Estos analitos son comúnmente detectados mediante inmunoensayos competitivos, en donde el anticuerpo específico se encuentra en cantidades limitantes, limitando consigo la sensibilidad del ensayo. Diversas estrategias han surgido con el fin de generar inmunoensayos no-competitivos para analitos pequeños. Una de ellas surge en el laboratorio de Inmunoquímica de la Cátedra de Inmunología y se basa en la detección del inmunocomplejo (anticuerpo-analito) a través de péptidos cortos cíclicos expresados en partículas derivadas de fago o en proteínas multiméricas. Las proteínas multiméricas asociadas a los péptidos anti-inmunocomplejos se denominan nanopeptámeros y han permitido el desarrollo de inmunoensayos colorimétricos más sensibles que su contraparte competitiva, demostrando su eficacia en la detección de distintos herbicidas. Con el fin de generar inmunoensayos no-competitivos más sensibles, en este trabajó se apuntó a generar nanopeptámeros acoplados a señal luminiscente. Así, se expresaron de forma recombinante quimeras compuestas por un péptido específico contra el analito atrazina (13A) en fase con la proteína verotoxina y con la enzima luminiscente NanoLuc. Alternativamente, también se expresó de forma recombinante la estreptavidina en fase con la NanoLuc para su posterior asociación con péptido 13A biotinilado. Ambas quimeras no fueron aptas para la detección de atrazina, siendo que la enzima NanoLuc no resultó compatible con el formato multimérico de dichas construcciones a la vez que el péptido recombinante 13A no demostró detectar de forma específica el inmunocomplejo (anticuerpo-atrazina). En su lugar, se realizaron ensayos con Estreptavidina-Peroxidasa en conjunto con péptidos biotinilados y posterior detección luminiscente utilizando el sustrato comercial luminol. De esta forma, fue posible adaptar un ensayo basado en nanopeptámeros a un formato luminiscente, generando curvas de detección de atrazina de sensibilidad comparable a las previamente reportadas para otros nanopeptámeros y otros ensayos no-competitivos de detección de atrazina.