Silenciamiento del gen notch3 mediante edición genómica en pez cebra: evaluación del efecto sobre la diferenciación de fotorreceptores

Abstract

La retina es un componente del sistema nervioso central que está conformado por diferentes tipos neuronales organizados de manera laminar, entre los cuales se encuentran los fotorreceptores. La vía de señalización de Notch tiene un papel esencial en el desarrollo del sistema nervioso. En particular, en el desarrollo de la retina de vertebrados se la ha asociado con el mantenimiento de una progenie de progenitores neurales gracias a un proceso de inhibición lateral. A su vez, se ha observado que en el desarrollo del pez cebra, una inhibición de esta vía provoca alteraciones en el ordenamiento de fotorreceptores en la capa nuclear externa, así como también, una disminución del tamaño de la retina con un aumento de muerte celular. Considerando que en el pez cebra la familia génica notch está conformada por cuatro genes, estudiar individualmente estos genes podría proporcionar información importante sobre el desarrollo de la retina y en particular de los fotorreceptores. Es así que en esta tesina estudiamos los efectos de la edición genética del gen notch3 mediante el sistema CRISPR/Cas9 sobre el desarrollo de la retina. Para ello, diseñamos cuatro ARNg que fueron co-inyectados con la endonucleasa Cas9, generando embriones crispantes que evaluamos en diferentes estadios de desarrollo. Observamos que los crispantes presentan un fenotipo externo característico con la presencia de edema cardíaco y una reducción en el tamaño de los ojos. Al evaluar el fenotipo retiniano de estos embriones encontramos que, a pesar de tener un tamaño reducido, las retinas presentan todas las capas celulares y no hay un aumento de la muerte celular. Sin embargo, observamos alteraciones en la organización de diferentes tipos celulares. Los conos dobles y bastones, que en embriones control se disponen formando una capa nuclear uniforme, en crispantes se agrupan en ciertas regiones de la capa. Por otra parte, las células ganglionares de la retina también presentaron alteraciones en su distribución ya que distinguimos células marcadas con un anticuerpo específico en la capa nuclear interna, es decir, fuera de los límites de la capa de células ganglionares de la retina. Por último, también existieron defectos en la capa plexiforme interna, observamos específicamente alteraciones en la región nasal. En conjunto nuestros resultados indican que notch3 tiene un rol importante en el desarrollo de la retina en el pez cebra.