Protección del ácido clorogénico frente a lesiones inducidas por benzo[a]pireno en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

El objetivo del presente estudio fue analizar el efecto del ácido clorogénico, uno de los compuestos polifenólicos con mayor concentración en la infusión de Ilex paraguariensis, sobre el daño celular y molecular inducido por el benzo[a]pireno. La infusión de Ilex paraguariensis (“mate”) es bebida por la mayoría de los habitantes de Argentina, Paraguay, sur de Brasil y Uruguay. La levadura Saccharomyces cerevisiae (cepas SC7K lys2-3; SX46A y SX46A rad14Δ) se utilizó como modelo eucariota. Las células en crecimiento exponencial se expusieron a concentraciones crecientes de benzo[a]pireno y a tratamientos combinados con una concentración de 250 ng/mL de benzo[a]pireno y ácido clorogénico a una concentración igual a la encontrada en la infusión de yerba mate. Luego de los tratamientos se determinaron fracciones de sobrevida, frecuencia mutagénica y roturas de doble cadena de ADN así como la modulación en la expresión de la proteína Rad14 a través de un análisis de Western Blot. Se observó un aumento significativo en las fracciones de sobrevida así como una disminución en la frecuencia mutagénica después de la exposición combinada con benzo[a]pireno y ácido clorogénico en comparación con los tratamientos con benzo[a]pireno como único agente. En la cepa mutante deficiente en la proteína Rad14 se observó un aumento significativo en la sensibilidad a benzo[a]pireno en comparación con la cepa SC7K lys2-3. En los tratamientos combinados de benzo[a]pireno y ácido clorogénico se observó una importante disminución de la letalidad. Con respecto a la determinación de roturas de doble cadena de ADN no se observó fraccionamiento cromosómico a la concentración de benzo[a]pireno utilizada en los experimentos. Los análisis de Western Blot mostraron un aumento en la expresión de la proteína Rad14 en las muestras tratadas con benzo[a]pireno como único agente en comparación con la muestra control. Adicionalmente se observó una disminución en la expresión de la proteína cuando en los tratamientos se utilizaron benzo[a]pireno y ácido clorogénicocombinados. Los resultados indican que el ácido clorogénico disminuye significativamente la actividad mutagénica producida por el benzo[a]pireno, la cual no se encuentra relacionada con un incremento en la remoción de las lesiones inducidas por el sistema de reparación por escisión de nucleótidos.

The aim of this study was to analyze the effect of chlorogenic acid, a polyphenolic compound found at highconcentrations in Ilex paraguariensis infusions, on cellular and molecular damage induced by benzo[a]pyrene. Ilex paraguariensis infusions (“mate”) are consumed by most of the population in Argentina, Paraguay, southern Brazil and Uruguay. Saccharomyces cerevisiae yeast (SC7K lys2-3; SX46A and SX46A rad14Δ strains) were usedas eukaryotic model organisms. Cells in an exponential growth phase were exposed to increasing concentrations of benzo[a]pyrene, as well as combined treatments of benzo[a]pyrene at a concentration of250 ng/mL and chlorogenic acid at a concentration matching that which is commonly found in mate. Determinations of surviving fraction, mutagenic frequency and double strand DNA breaks induction wereperformed, along with the assessment of the modulation of the expression of protein Rad14 by Western Blot. A significant increase of surviving fractions and a decrease in mutagenic frequency were observed afte rexposure to benzo[a]pyrene plus chlorogenic acid, contrary to benzo[a]pyrene alone. A substantial increase insensitivity to benzo[a]pyrene was observed for the Rad14 protein-deficient mutating strain when compared to the SC7K lys2-3 strain. An important decrease in lethality was observed when combined benzo[a]pyrene andchlorogenic acid treatments were applied. As for the determination of DSBs, no chromosomic fractionation was observed at the benzo[a]pyrene concentration tested in the experiments. Western Blot analysis showedan increase in the expression of protein Rad14 for samples treated with benzo[a]pyrene as a single agentwhen compared against the control sample. Additionally, the expression of this protein was observed to diminish when combined treatments with benzo[a]pyrene and chlorogenic acid were used. Results obtained indicate that chlorogenic acid significantly decreases the mutagenic activity of benzo[a]pyrene, which is not related to an increase in the removal of lesions induced by nucleotide excision repair system.

O objetivo deste estudo foi analisar o efeito do ácido clorogênico, um dos compostos polifenólicos com maior concentração na infusão de Ilex paraguariensis, sobre o dano celular e molecular induzido pelo benzopireno. A infusão de Ilex paraguariensis (“mate”) é consumida pela maioria dos habitantes da Argentina, Paraguai, sul do Brasil e Uruguai. A levedura Saccharomyces cerevisiae (cepas SC7K lys2-3; SX46A e SX46A rad14Δ) foi utilizada como modelo eucariótico. Células em crescimento exponencial foram expostas a concentrações crescentes de benzopireno e tratamentos combinados foram realizados com uma concentração de 250 ng/mL de benzo[a]pireno e ácido clorogênico, igual à encontrada na infusão de erva-mate. Após os tratamentos, foram determinadas as frações de sobrevivência, frequência mutagênica e quebras de fita dupla do DNA, bem como amodulação na expressão da proteína Rad14 por meio de análise de Western Blot. Um aumento significativo nasfrações de sobrevivência, bem como uma diminuição na frequência mutagênica foram observados após aexposição combinada de benzo[a]pireno e ácido clorogênico em comparação com tratamentos de agente únicode benzo[a]pireno. Um aumento significativo na sensibilidade ao benzo[a]pireno foi observado na cepa mutante deficiente em proteína Rad14 em comparação com a cepa SC7K lys2-3. Nos tratamentos combinados debenzo[a]pireno e ácido clorogênico, observou-se uma diminuição significativa na letalidade. Com relação à determinação das quebras de fita dupla de DNA, não foi observado fracionamento cromossômico na concentração de benzo[a]pireno utilizada nos experimentos. A partir da análise de Western Blot, observou-se um aumento na expressão da proteína Rad14 nas amostras tratadas com benzo[a]pireno como agente único em relação à amostra controle. Além disso, uma diminuição na expressão da proteína foi observada quando combinados de benzo[a]pireno e ácido clorogênico foram usados nos tratamentos. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o ácido clorogênico diminui significativamente a atividade mutagênica produzida pelo benzo[a]pireno, a qual não está relacionada a um aumento na remoção de lesões induzidas pelo sistema dereparo por excisão de nucleotídeos.