Modulación de la NADPH oxidasa fagocítica por ácido nitroaraquidónico

Abstract

El derivado nitrado del ácido araquidónico (AA), el ácido nitroaraquidónico (NO2AA) presenta actividades antiinflamatorios celulares durante la activación de los macrófagos. Sin embargo, se sabe poco acerca de la capacidad del NO2AA para regular la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en condiciones proinflamatorias. Una de las respuestas inmediatas tras la activación de macrófagos implica la producción de radical superóxido (O2⎯) por la enzima NADPH oxidasa fagocítica (NOX2). Como el AA es capaz de activar a la NOX2, proponemos que NO2AA puede modular la activación de los macrófagos mediante al inhibir la formación de O2⎯ por NOX2. Cuando los macrófagos se activaron en presencia de NO2AA, se observó una inhibición significativa de la actividad NOX2 evaluadas por la reducción de citocromo c, la luminiscencia de luminol, la fluorescencia del Amplex Red y por citometría de flujo. Este proceso también se produce en el fagosoma, sin afectar la viabilidad celular ni la fagocitosis. El NO2AA disminuyó la producción de O2⎯ de forma dependiente de la dosis y del tiempo de incubación siendo un efecto reversible. La inhibición observada no fue debida a una disminución de la fosforilación de las subunidades citosólicas (p40phox y p47phox). Sin embargo, se observó una reducción de la migración a la membrana de p47phox lo que implica la prevención del correcto montaje de la enzima activa en la membrana. Los efectos observados in vitro se comprobaron en un modelo inflamatorio agudo in vivo mediado por tioglicolato, donde la inyección subcutánea de NO2AA fue capaz de disminuir la actividad NOX2 en los macrófagos de ratones tratados, confirmando los efectos observados en los estudios celulares. Trabajos recientes indican la participación de la Proteína Disulfuro Isomerasa (PDI) en la activación de NOX2. Creemos que el NO2AA podría afectar directamente a la PDI provocando la inhibición de la actividad NOX2. El NO2AA inhibió las actividades tanto reductasa como chaperona de la PDI de forma dependiente de la dosis y del tiempo de incubación siendo independiente del NO liberado por el NO2AA. Como los nitroalquenos son potentes electrófilos y la PDI tiene residuos de cisteína críticos para su actividad, podría formarse un aducto covalente reversible entre NO2AA y PDI. Hemos demostrado la modificación covalente reversible de PDI por NO2AA en residuos de cisteínas usando el ensayo de PEG-switch, así como LCMS/ MS, determinando la modificación de residuos de cisteína del sitio activo de 4 PDI. Además, los estudios de microscopía confocal demostraron que el pretratamiento con NO2AA en macrófagos activados con PMA presenta un cambio en la distribución intracelular de PDI así como cambios en la estructura de actina. El inhibidor de PDI Tiomuscimol presentó un efecto similar al nitroalqueno tanto en la distribución de PDI como en la inhibición de NOX2, lo que indica que la inhibición de NOX2 por NO2AA puede ser debido a la inhibición de la PDI. Asimismo, la colocalización de p47phox con PDI se vio disminuida en presencia del NO2AA, pudiendo afectar la función de PDI sobre la actividad NOX2. En resumen, nuestros resultados implican que las modificaciones covalentes por NO2AA en PDI podrían afectar la función moduladora de PDI en la NOX2, evitando su interacción con p47phox y su migración a la membrana, necesarios para la activación de la NOX2.