I. desarrollo de herramientas para denitrosar y etiquetar s-nitrosotioles biológicos. II. Evaluación de la capacidad antioxidante de propoleo uruguayos

Abstract

EI óxido nitrico ("NO) es un mensajero biol6gico sumamente importante y versatil, involucrado en la neurotransmisi6n, el mantenimiento de la homeostasis vascular y en los mecanismos primarios de la defensa inmune. Es un radical libre producido in vivo por un grupo de enzimas lIamada Oxido Nitrico Sintasas (NOS). Los efectos del NO estan mediados por reacciones directas con hemoproteinas 0 mediante especies reactivas derivadas de reacciones del NO con oxigeno, super6xido y metales. La nitrosaci6n de tioles proteicos es una modificaci6n dependiente de NO que ha tomado un gran protagonismo ultimamente, ya que estarla implicada en mecanismos de serializaci6n celular. A pesar de haberse encontrado mas de 100 protefnas con cistefnas modificadas por S-nitrosaci6n, aun es necesario establecer cuales son los mecanismos par los que se forman y descomponen estos compuestos in vivo. Para esto es necesario contar con una tecnica de identificaci6n y caracterizaci6n de S-nitrosotioles (RSNO) eficiente. Se han desarrollado varios metod os para la cuantificaci6n y determinaci6n de RSNO de bajo peso molecular y proteicos, entre ellos encontramos el metodo de Saville, la quimioluminiscencia y el biotin switch. EI biotin switch es el metodo de referencia para la identificaci6n de proteinas S-nitrosadas, pero sufre de baja reproducibilidad en los resultados. Esta tecnica se basa en la reducci6n del RSNO con ascorbato, dejando los tioles libres para la uni6n con un reactivo biotinilado, marcando especificamente los tioles que se encontraban nitrosados. La eficiencia del ascorbato como agente reductor ha mostrado ser variable y dependiente de la muestra biol6gica a analizar, y se ha identificado como el punto debil de la tecnica de biotin switch. Por esta raz6n nos planteamos estudiar metodologias alternativas para la denitrosaci6n de RSNO. En este trabajo se ensay6 en primer lugar la capacidad de halogenuros, seudohalogenuros, y una variedad de organomercuriales, de denitrosar RSNO de bajo peso molecular (S-nitrosoglutati6n) y proteicos (S-nitrosoalbumina y S-nitrosotiorredoxina). Demostramos que el ioduro tiene una capacidad denitrosante significativa, destacandose dentro de los halogenuros ensayados. Por otro lado se via que los organomercuriales efectivamente reaccionan con RSNO, provocando la denitrosaci6n y uniendose a los tioles. En funci6n de los resultados obtenidos se evalua la utilidad de estos organomercuriales como potenciales herramientas para el desarrollo de una nueva tecnica de descomposici6n e identificaci6n especifica de S-nitrosotioles.